一、实验目的

建立基于芬兰Kibron表面张力分析仪动态张力曲线的蛋白药物界面聚集行为定量检测方案，通过动态表面张力随时间变化的曲线特征，直观判定蛋白在气液界面的吸附速率、构象展开程度与界面聚集等级，用于单抗、重组蛋白、多肽类药物制剂稳定性评价，预判搅拌、灌装、冻融过程中界面诱导蛋白聚集风险，同时筛选可抑制界面聚集的处方辅料与缓冲体系。


二、实验前期准备

1. 仪器与耗材准备

选用芬兰Kibron系列表面张力分析仪，单通道机型采用Epsilon型号，高通量批量筛选选用Delta-8八通道机型，配套DyneProbe金属威尔helmy探针、温控模块、张力数据采集软件、石英微量样品杯或96孔DynePlate微孔板。辅助耗材包含18.2 MΩ·cm超纯水、0.22 μm水系无菌滤膜、无菌离心管、微量移液枪、无水乙醇、氮气吹扫瓶、无粉乳胶手套。

探针预处理：每次测试前使用丁烷火焰充分灼烧DyneProbe探针，彻底去除吸附的蛋白残留与有机物，自然冷却至室温后卡入张力传感器固定位。高通量Delta-8机型每块微孔板测试完成后启动仪器自动高温清洁程序，防止通道交叉污染。

仪器环境与参数预设：将设备放置在减震台面，远离空调直吹风、离心机震动干扰源，开机预热30分钟，设定实验温度25±0.5 ℃，蛋白药物模拟体内环境可调整至37 ℃。启动采集软件完成硬件自检，确认探针升降位移、张力信号采集无异常。所有样品杯或微孔板依次用乙醇、超纯水冲洗，氮气吹干备用，禁止手部触碰液体接触内壁。


2. 蛋白样品与缓冲液配制

基础缓冲液配制：按照蛋白药物处方体系配制缓冲液，常用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液，精准调节目标pH值，配制后经0.22 μm滤膜过滤，超声脱气30分钟去除溶解气泡，静置冷却至室温。

待测蛋白工作液配制：原液蛋白溶液轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡预先引入界面聚集；存在微量可见颗粒的样品先低速离心取上清液，再用0.22 μm低蛋白吸附滤器过滤，去除本体预聚体干扰。根据实验梯度，用脱气缓冲液稀释成不同蛋白浓度工作液，现配现测，全程避光低温暂存。

对照组溶液设置：空白缓冲液对照组（仅缓冲体系）、未强制应力处理的新鲜蛋白单体对照组、搅拌/高温胁迫诱导的高聚集阳性对照组、添加吐温等保护辅料的制剂对照组，所有对照组溶剂体系、渗透压完全保持一致。


3. 基线校准与空白体系验证

向样品杯或微孔中加入脱气空白缓冲液，放置于温控平台，等待温度稳定，探针完全浸润液相后静置平衡20分钟，在软件执行基线归零操作。

连续记录空白缓冲液表面张力30分钟，若数值波动小于0.2 mN/m，判定基线稳定；波动超标则重新清洁探针与容器、更换脱气缓冲液。记录空白缓冲液平衡表面张力数值，作为后续所有样品的本底参照标准。随机选取点位重复测量3次，验证通道平行性，通道间张力差值稳定后方可正式上样。


三、动态张力完整上机操作流程

1. 样品加样与体系静置平衡

单通道微量杯操作：向洁净样品杯中加入150–200 μL蛋白待测液，动作平缓沿杯壁加注，避免产生大量微小气泡，液面无气泡方可继续实验。将样品杯平稳卡入仪器温控台，静置5分钟消除移液扰动，等待液面相态完全稳定。

高通量96孔板操作：每孔统一加入50 μL蛋白工作液，按照预设排布放置待测样品、各类对照组与复孔，加样完毕轻封封板膜避光静置30分钟，保证蛋白分子在本体溶液中分布均匀，揭膜后检查孔内气泡，含气泡孔作废重新加样。将微孔板水平卡入仪器载板卡槽，确认卡位牢固不晃动。


2. 动态表面张力连续采集设置

在采集软件新建测试方案，选择时间依赖性动态张力采集模式，设置总采集时长120分钟，对于界面聚集缓慢的抗体类蛋白可延长至180分钟，软件自动连续记录表面张力随时间变化曲线。

单通道模式手动调整探针下降至刚好接触气液界面，启动程序自动采集；Delta-8高通量模式设置逐行扫描顺序，八通道同步并行测量，整块板自动完成数据采集。

程序运行期间全程关闭仪器防风罩，杜绝气流扰动液面造成曲线漂移。单一样品至少独立重复测试3次平行实验。


3. 样品更换与防污染操作

单通道每完成一组蛋白样品测试，升起探针再次火焰灼烧清洁，倒掉废液，样品杯经乙醇浸泡、纯水冲洗、氮气吹干后再测试下一个样品。不同聚集程度、不同处方蛋白样品分批测试，先测低聚集新鲜单体样品，后测高聚集胁迫样品，减少大分子蛋白在探针表面不可逆吸附残留。

高通量机型每测试完成一块微孔板，自动执行探针高温清洁程序，再放入下一块待测板，不同批次板之间插入空白缓冲孔复测，监控仪器基线漂移。


四、数据处理、曲线特征与聚集程度判定标准

1. 原始数据提取与整理

从Kibron配套软件导出动态表面张力-时间原始曲线，提取四项核心判定参数：诱导期时长、张力下降速率、最终平衡表面张力、平台期曲线稳定性。汇总平行样品数据，计算平均值用于横向对比不同样品聚集差异。


2. 张力曲线对应蛋白界面聚集等级判定规则

一级，低界面聚集风险（新鲜单体蛋白）：曲线诱导期短，表面张力快速大幅下降，下降斜率陡峭，较短时间内进入平稳平台期，平衡表面张力数值偏低且长期保持稳定。说明蛋白单体扩散至界面速度快，界面仅发生可逆吸附与轻微构象舒展，分子间交联少，不易形成界面聚集体，制剂搅拌、灌装过程稳定性较好。

二级，中度界面聚集风险：张力下降前期速率偏慢，诱导期明显拉长，缓慢下降阶段持续时间久，平台期存在小幅缓慢向下漂移。代表蛋白在界面逐步发生分子间疏水相互作用、二硫键交联，缓慢形成二维界面蛋白凝胶层，长时间放置后会脱落进入本体溶液产生亚可见颗粒，属于需要处方优化的中等风险样品。

三级，高界面聚集风险（大量界面聚集）：整体张力下降幅度微弱，长时间无法达到稳定平台，曲线持续不规则波动；或是前期短暂下降后出现张力小幅回升。该特征说明蛋白大量在界面发生不可逆构象变性、堆叠形成致密聚集体，界面吸附膜结构坍塌，是典型的界面诱导强聚集行为，在生产工艺中极易产生蛋白颗粒、絮状物，存在免疫原性风险。

对比添加表面活性剂保护剂的组别，若张力曲线恢复为单体蛋白特征，可直接验证辅料抑制界面聚集的效果。


3. 实验全程质控关键要点

所有蛋白溶液必须充分脱气，溶解气体造成液面微扰动会直接扭曲动态张力曲线形态，导致聚集程度误判。

实验环境禁止有机溶剂挥发、风扇直吹，微量液体水分蒸发会提升蛋白浓度，改变吸附动力学行为。

蛋白大分子极易不可逆吸附在金属探针表面，样品之间必须严格执行灼烧清洁步骤，避免交叉污染导致曲线失真。

不同组别测试时，温度、样品体积、探针浸入深度、采集时长全部保持统一，保证多批次数据具备可比性。

胁迫处理后的高聚集蛋白样品避免反复冻融，防止本体聚集程度进一步改变，影响界面行为对应关系。


五、实验注意事项

1. 蛋白样品移液、加注全程轻柔操作，不得剧烈涡旋、吹打产生大量泡沫，泡沫会预先造成蛋白界面变性，干扰真实界面聚集测试结果。

2. 滤膜选用低蛋白吸附材质，过滤步骤不可省略，本体预先存在的聚集体会降低扩散速率，改变张力曲线下降趋势，无法真实反映界面诱导聚集能力。

3. 超微量动态张力测量对震动极度敏感，实验过程中台面禁止放置运行中的离心机、振荡器，人员不要在仪器周边频繁走动。

4. 若需要长期跟踪蛋白储存过程聚集变化，需固定取样时间点，所有测试参数完全复刻初始条件，确保前后曲线可对比。

5. 张力曲线仅作为界面聚集倾向性初筛结果，高风险样品后续可结合SEC-HPLC粒径排阻色谱、DLS粒度检测进行聚集物定量验证。

6. 实验结束后探针、样品杯彻底清洗烘干，长期残留蛋白会造成后续所有基线偏移，影响后续其他样品测试精度。