一、实验目的

1. 依托芬兰Kibron Delta-8八通道高通量表面张力分析仪，建立批量、标准化的生物类似药蛋白动态表面张力检测方法，通过界面吸附动力学曲线评价单抗、融合蛋白等生物类似药在气液界面的吸附、构象舒展与界面诱导聚集倾向。

2. 批量筛选缓冲体系pH、离子强度、保护辅料、防腐剂、蛋白浓度等变量对蛋白界面稳定性的影响，快速区分候选处方之间的稳定性差异。

3. 建立张力曲线特征与蛋白界面聚集风险的对应判定规则，预判生产搅拌、过滤、灌装、冻融等工艺过程中蛋白变性、颗粒产生风险，为生物类似药处方开发、工艺稳健性评估、与原研药界面行为一致性比对提供量化依据。


二、实验前期准备

1. 仪器与耗材准备

仪器主体为芬兰Kibron Delta-8高通量动态表面张力仪，配套八通道DyneProbe探针组、探针高温自动清洁模块、恒温控制系统、配套数据分析软件、96孔DynePlate聚丙烯微孔测试板。

辅助耗材包括18.2 MΩ·cm超纯水、各类药用缓冲盐、甘露醇、海藻糖、组氨酸、吐温20等保护辅料、待测生物类似药原液、原研参比品、0.22 μm低蛋白吸附水系滤器、无菌离心管、多通道移液枪、无粉乳胶手套、无水乙醇。

探针预处理：设备开机后启动全自动高温灼烧清洁程序，对8根探针同步高温除杂，去除上一轮残留蛋白与有机物，冷却完成后仪器自动归位。单次整板测试结束必须再次执行探针整体清洁，避免通道交叉污染。

仪器环境与参数设定：仪器放置于减震大理石台面，远离离心机、振荡器、空调直吹气流，整机通电预热30 min，设置实验温度25±0.5 ℃，模拟室温工艺条件；如需模拟体内温度可设置37 ℃。启动软件完成通道自检、位移校准、张力传感器零点校验，确认8个通道平行性误差小于0.2 mN/m。

微孔板预处理：96孔板使用超纯水轻柔冲洗，自然晾干，避免塑料析出物影响界面测量，全程禁止手触碰板底与孔内液面接触区域。


2. 溶液体系配制与样品分组设计

基础缓冲液配制：按照生物药常用处方分别配制磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液，梯度调节pH值与氯化钠离子强度，全部经0.22 μm滤膜过滤，超声脱气30 min彻底去除溶解气泡，室温静置备用。

蛋白工作液配制：生物类似药原液轻柔颠倒混匀，禁止剧烈涡旋产生预聚集；若存在微量亚可见颗粒，采用低速短时离心取上清，再经低蛋白吸附滤器过滤除去本体预聚体。使用不同缓冲液梯度稀释为统一蛋白浓度工作液，现配现测，全程避光、低温暂存。

变量梯度实验组设置

第一组，缓冲环境变量：不同pH梯度、不同离子强度梯度体系；

第二组，保护辅料变量：不同浓度吐温20、海藻糖、甘露醇、精氨酸等稳定剂梯度添加；

第三组，浓度变量：不同蛋白质量浓度梯度；

第四组，参比对照：原研药同等条件稀释液、空白缓冲液、强制氧化/搅拌胁迫高聚集阳性对照。

所有实验组仅保留单一变量，溶剂渗透压、助溶剂终浓度保持完全一致，消除体系背景干扰。


3. 基线校准与空白质控验证

在96孔板预留空白缓冲孔，加入脱气后的空白缓冲液，将微孔板卡入仪器载板，执行基线采集。

连续采集空白缓冲液动态表面张力30 min，单通道数值波动小于0.2 mN/m判定基线稳定，8个通道之间张力差值均匀无明显偏差，方可正式上样检测。

记录空白缓冲液平衡表面张力作为本底，后续所有样品数据均以此为扣除基准。每测试3块微孔板插入一板空白板复测，监控仪器长时间运行基线漂移。


三、高通量完整上机操作流程

1. 96孔板标准化加样操作

每孔统一加入50 μL蛋白待测工作液，使用多通道移液枪匀速加样，沿孔壁缓慢注入，避免冲击液面产生微小气泡，孔内出现气泡直接作废重新加样。

按照预先排版排布待测样品、技术复孔、各类对照组，同一变量梯度连续排布，方便后续批量对比。加样完成后使用透明封板膜轻轻密封微孔板，室温避光静置20 min，使蛋白分子在液相中分布均匀，减少移液扰动带来的初始界面行为异常。

小心揭除封板膜，再次检查孔内气泡，确认无气泡后将微孔板平稳卡入Delta-8仪器卡槽，锁定载板防止运行过程位移。


2. 动态表面张力高通量采集设置与运行

在软件内新建高通量测试方案，选定动态表面张力时间扫描模式，设置单孔采集总时长90 min，对于界面吸附极慢的单抗样品可延长至120 min，仪器自动逐行移动载板，八通道同步并行采集每一个孔位张力随时间变化曲线。

设置探针浸入深度、停留时间统一参数，全程关闭仪器外防风罩，隔绝环境气流扰动。整块板自动测量完成后，软件自动保存全部原始曲线数据。

同一批次所有实验组至少设置2块独立配制的微孔板平行测试，出现稳定性异常的处方单独复测验证结果可靠性。


3. 板间防污染与仪器阶段性维护

每一块微孔板测试完毕，立即启动探针全自动高温灼烧清洗程序，彻底去除不可逆吸附在金属探针表面的蛋白分子，避免高聚集样品污染后续低聚集样品。

不同风险等级样品遵循先低聚集新鲜样品、后胁迫处理高聚集样品的测试顺序，最大程度降低交叉吸附干扰。单日全部实验结束后，执行一次整机深度校准，记录环境温湿度与设备运行状态。


四、数据处理、稳定性判定标准与处方筛选规则

1. 数据导出与核心参数提取

从配套分析软件批量导出所有孔位动态表面张力-时间原始曲线，批量提取四项关键指标：张力诱导期时长、表面张力下降速率、吸附平衡表面张力、平台期曲线稳定性。

汇总平行样品数据计算平均值，将曲线特征与蛋白界面稳定性直接对应，建立批量处方筛选数据表。


2. 蛋白界面稳定性等级判定规则

一级，界面稳定性优异（低聚集风险，可作为优选处方）

动态张力诱导期较短，张力快速陡峭下降，短时间内进入平稳平台区，平衡张力长期无漂移。代表蛋白分子仅发生可逆界面吸附，构象舒展程度低，分子间几乎不发生疏水交联与二硫键错配，在搅拌、灌装工艺中不易产生界面诱导颗粒，可与原研药界面行为高度匹配。


二级，界面稳定性一般（中等聚集风险，需优化处方）

张力诱导期明显拉长，下降速率平缓缓慢，平台期曲线存在缓慢向下小幅漂移。说明蛋白在界面逐步发生构象改变，二维界面缓慢形成蛋白寡聚体，长期放置或多次工艺循环后聚集体脱落进入本体溶液，存在亚可见颗粒超标风险，需要优化缓冲pH或补充稳定剂。


三级，界面稳定性差（高聚集风险，直接淘汰处方）

整体张力下降幅度微弱，长时间无法达到稳定平台，曲线不规则震荡波动；或是短暂下降后张力反向回升。代表蛋白在气液界面发生不可逆变性、大量堆叠形成界面蛋白膜，膜结构坍塌脱落，极易出现肉眼可见絮状物、颗粒，生物类似药质量不达标，直接排除该处方。


同时可对比添加稳定剂前后曲线变化，若加入吐温、氨基酸后曲线恢复为稳定单体特征，直接量化辅料对蛋白界面的保护效果。


3. 高通量筛选应用要点

利用Delta-8八通道高通量能力，单次可完成上百组缓冲、辅料、浓度变量初筛，仅对筛选出的少量稳定处方开展SEC-HPLC粒径排阻色谱、DLS粒径检测、浊度测定进行二次验证，极大缩减生物类似药处方研发周期。

长期稳定性留样考察中，按月度复测同一处方动态张力曲线，若平衡张力明显升高、曲线形态劣变，可提前预警储存过程蛋白构象稳定性下降。

通过张力曲线相似度比对，可完成生物类似药与原研药界面行为一致性评价，支持药学一致性评价资料撰写。


五、实验注意事项

1. 生物类似药蛋白极易受机械剪切影响，取样、稀释、加样全程动作轻柔，严禁剧烈吹打、涡旋，避免预先产生界面变性，导致张力测试结果失真。

2. 所有待测溶液必须充分超声脱气，微孔内微小气泡会造成张力曲线无序波动，无法真实反映蛋白界面吸附行为。

3. 探针高温清洁步骤不可省略，蛋白大分子在金属表面吸附能力极强，残留污染会造成后续所有样品数据系统性偏差。

4. 全批次实验温度、加样体积、采集时长、探针浸入参数完全统一，仅设置单一变量，保证不同组别数据具备统计学可比性。

5. 实验环境严格杜绝震动、空调直吹微孔板，微量液体水分蒸发会造成蛋白浓度升高，改变界面吸附动力学。

6. 高通量张力筛选仅为界面稳定性体外间接评价手段，最终处方必须结合强制降解试验、长期稳定性留样、体内药效学试验综合确认。