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LB 膜分析仪——​简单Langmuir-Schaefer法制备蛋白质纳米孔膜

来源: 浏览 101 次 发布时间:2024-05-30

研究简介:选择性和渗透率通过界面聚合,制备了顶层薄而致密的复合膜。虽然优化这种膜是很先进的,但在这种密集的选择层上传输需要高跨膜压力和高能量消耗。在细胞尺度上,生物膜满足上述许多标准。生物膜将细胞或细胞组分分开,并且主要由厚度小于10nm的致密磷脂双层组成。磷脂双层包含膜蛋白,其使得信号传递和分子选择性转运穿过膜。连接膜两侧的膜蛋白被称为跨膜蛋白,并且一些跨膜蛋白(TP)形成纳米孔。研究人员将铁蛋白聚合物偶联到超薄膜上,并通过蛋白质变性形成纳米孔。使用天然成孔跨膜蛋白代替铁蛋白,合成了跨膜蛋白(TP)聚合物缀合物,其通过在Pickering乳液界面处的组装和随后的聚合物链的UV交联转化成稳定的膜。提出了一个简单的方法集成到平面超薄膜的功能性跨膜蛋白(TP),这种策略是基于Langmuir技术和同双官能团交联剂戊二醛,是一种有效的蛋白质交联剂和已知的不影响蛋白质构象在许多情况下。在研究中,FhuA分子在朗缪尔槽的空气-水界面处铺展。在用Langmuir槽的两个可移动屏障压缩时,形成致密的2D膜并通过戊二醛交联稳定。使用Langmuir-Schaefer方法将单层或多层交联的FhuA膜转移到各种基底材料上。


Kibron LB 膜分析仪的的应用


用乙醇彻底清洁Langmuir槽,用Millipore纯水冲洗,并填充磷酸盐缓冲液。随后,将Langmuir槽的屏障完全封闭,吸附的颗粒从空气-水界面吸走,磷酸盐缓冲液从屏障后面重新填充。重复该过程,直到在完全屏障压缩时测量的清洁空气-水界面的表面压力的上升小于或等于0.05mN/m-1在典型的膜制造实验中,将50μL FhuA溶液(FhuA浓度为6.3×10-6 M的MPD缓冲液中)加入到反应器中。平衡2小时后,将朗缪尔槽的屏障设置为以1 mm/min的速度运动将吸附的FhuA单层压缩至25 mN/m的表面压力,在保持表面压力恒定的同时,将1.76mL戊二醛溶液(50wt%的H2O溶液)加入到反应器中。在空气中干燥之前,将转移的FhuA膜在MPD溶液(5%体积MPD的Millipore纯水溶液)中通过浸渍三次来洗涤。平衡2小时后,Langmuir槽的屏障以1 mm min-1的速度运动,将吸附的FhuA单层压缩到25 mN m-1的表面压力。在保持表面压力不变的情况下,将1.76 mL戊二醛溶液(50 wt%in H2O,Sigma-Aldrich,USA)从Langmuir槽屏障后注入磷酸盐缓冲亚相。交联至少进行2小时,直到FhuA膜按照Langmuir-Schaefer方法转移到相应的底物上。在空气中干燥之前,将转移的FhuA膜在MPD溶液(5 vol%MPD在Millipore纯净水中)中浸洗三次。


实验结果


介绍了一种制造超薄但机械稳定的膜的新方法,该膜包含TP FhuA,其天然形成限定的纳米孔。由于其厚度低和本研究中推断的极高密度的集体对齐蛋白质,与常规纳滤膜相比,这种膜具有非常高的水渗透性。由两种不同的FhuA变体制成的膜反映了每种变体的分子性质,在此关于离子渗透性进行了证明。我们的膜有潜力作为一个平台技术,允许定制膜根据个人的过程要求。膜制造使用了研究良好的Langmuir技术和一个共同的蛋白质交联剂,这确保了良好的可扩展性,着眼于未来的应用。

图1、跨膜蛋白FhuA的交联2D膜片。a)使用β-桶蛋白FhuA(跨膜蛋白铁羟酸盐摄取蛋白组分A)的两种变体。在FhuA WT中,软木结构域阻塞大部分孔内部,而该软木结构域被生物技术去除以形成开孔变体FhuA∆CVF电子伏特两种FhuA变体具有相同的尺寸,并且其特征在于蛋白质上部的亲水性环区和蛋白质下部的疏水性跨膜区。b)应用Langmuir技术形成超大2D FhuA膜片。(i)由于它们的两亲性,当扩散到空气-水界面时,FhuA分子占据很大程度上直立的取向。(ii)当在朗缪尔槽的屏障之间紧密压缩并与戊二醛交联时,FhuA膜片可以通过重复的水平浸渍层叠在基底的顶部。c)由FhuA WT(左)或FhuA∆CVF制成的膜的示意性俯视图电子伏特d)FhuA膜在水和离子渗透方面进行表征。

图2、a)在空气-水界面处的FhuA膜并转移到基底上。(i)吸附,(ii)压缩,和(iii)在膜制造期间从0.32nmol FhuA WT涂布在磷酸盐缓冲液顶部测量的谷面积-时间曲线在(ii)和(iii)中,戊二醛的注射用箭头标记。B)相应的BAM成像显示(i)在高达30 mN/m的表面压力下均质的FhuA膜-1.(ii)表面压力超逾30mN/m)(i)一个或(ii)两个FhuA膜片的AFM图像,所述膜片层叠在硅基底的顶部上(左半部分用注射器尖端刮去)。高度分布属于图像中的虚线,并且指示(i)5和(ii)9 nm的膜厚度。d)单个FhuAΔCVF的共聚焦荧光显微镜图像,用荧光标记物标记的硅衬底上的薄膜片e)独立地覆盖TEM网格(浅灰色)的结构化碳膜中的孔(深灰色)的FhuA WT膜的HIM图像。黑色区域显示膜中的缺陷。

图3、空气-水界面处的FhuA膜BAM(布吕斯特角显微镜)图。(a)在MPD缓冲液中扩散FhuA WT之前和(b)之后的Langmuir槽气-水界面BAM图像;和(c-f)在不同表面压力下的屏障压缩。涂敷后立即在空气-水界面上吸附一层致密均匀的FhuA WT膜。FhuA WT膜可以被压缩到高达25 mN/m的表面压力,而不会表现出不均匀性。在表面压力为30 mN/m时,在FhuA WT薄膜中可以看到垂直于压缩方向的细长裂纹。

图4、在FhuA单层膜上的AFM测量.a)当(i)未覆盖和(ii)覆盖有FhuA膜时在其中心具有单个孔的氮化硅膜窗口的示意图.(iii)在PeakForce QNM模式下AFM成像期间FhuA膜涂覆的氮化硅膜窗口的横截面(b-d)当(b)孔未被FhuA膜覆盖,(c)孔被破裂的FhuAΔCVF膜覆盖时,氮化硅膜窗口中的孔的AFM高度图像膜,和(d)孔被一个完整的FhuAΔCVFtev膜层覆盖(d)和(e)中的高度和变形图像是同时获得的,并且所有图像都是在水中测量的。(d)和(e)中的高度和变形曲线分别属于图像中的虚线。

图5、通过FhuA膜的水和离子渗透。a)覆盖有氮化硅膜窗口的充水容器的示意图,其用于测量FhuA WT膜的水渗透。由从杯内到杯外的水蒸气压差驱动(pi-p0)(a)中所示的杯子的照片。c)FhuA WT膜的水渗透性为3.87×104 mol Pa-1 m−2 s-1(空参考25.13×104 mol Pa-1 m−2 s-1误差条表示至少三个样品的平均值的标准误差。d)用于测量FhuA膜的离子渗透性的实验装置的示意图。离子在电极之间扩散的唯一方式是渗透氮化硅膜窗口中的孔顶部的FhuA膜。e)在磷酸盐缓冲液(10×10−3 m NaCl,10×10−3 m恒定斜率对应于4.0mS(空参比)、3.4mS(FhuA∆CVF)、3.4mS(FhuA∆CVF)和3.4mS(FhuA∆CVF)的电极之间的恒定电导.


总结


通过具有纳米孔的膜的过滤通常与高跨膜压力和高能量消耗有关。这个问题可以通过减少各自的膜厚度来解决。本研究描述了一种简单的方法来制备基于蛋白质纳米孔的超薄膜,该膜具有优异的透水性,比同类工业应用膜高出两个数量级。此外,结合封闭或开放的蛋白质纳米孔可以调整膜的离子渗透性。为了形成这样的膜,跨膜蛋白铁羟酸盐摄取蛋白组分A(FhuA)或其开孔变体在Langmuir槽的空气-水界面组装,压缩成致密膜,通过戊二醛交联,并转移到各种支撑材料上。这种方法可以制备具有高密度蛋白质纳米孔的单层或多层膜。通过原子力显微镜(AFM)、氦离子显微镜和透射电子显微镜可以看到覆盖直径达5μm孔的独立膜。AFM最大推力定量纳米力学性能映射(PeakForce QNM)表明,厚度仅为5 nm的独立单层膜具有显著的力学稳定性和弹性性能。这种新型蛋白质膜可以为节能纳滤铺平道路。