1.2.3培养液残留原油的提取、纯化和鉴定

采用重量法测定培养液中残留原油。取培养液使用正己烷萃取至清澈，合并有机相，40℃减压蒸馏除去正己烷得到原油，转移至称量瓶中氮气吹干后称取原油质量。然后称取约0.1g剩余原油通过硅胶柱层析，参考美国EPA.8270E(SW-846)方法进行柱层析分离饱和烃和不饱和烃组分，利用气相色谱质谱(GC-MS)联用仪(TSQ8000Evo美国ThermoScientific公司)分别测定饱和烷烃(包括姥鲛烷、植烷)和多环芳烃组分含量，方法为:取烷烃和芳烃洗脱液利用GC-MS测定，载气为He，载气流速1.0 mL/min;无分流自动进样，进样量1μL;升温程序为50℃保持2min，以6℃/min升温至300℃，保持15 min;进样口和检测器温度分别为280和300℃;质谱检测器采用EI离子源;离子源温度为230℃;定量采用SIM扫描方式。

依据公式(1)计算石油烃降解率:

式中:m0表示对照培养液中残余油含量(g·L-1);m1表示实验组培养液中残余油含量(g·L-1)。

1.2.4槐糖脂的提取、纯化和鉴定

将培养10d后的发酵液经等体积的乙酸乙酯萃取两次合并有机相，利用旋转蒸发仪(RE-52A上海亚荣生化仪器)40℃减压蒸馏除去乙酸乙酯得到黄色粗提产物。粗提产物用薄层层析(TLC)进行初步定性分析，以本实验室由S.bombicola发酵生产纯化后的槐糖脂纯品为标准样。展开剂为氯仿/甲醇/水(65∶15∶2，体积比)。显色剂为苯酚-硫酸试剂，在105℃显色5 min，糖类显棕色斑点。

所提取的产物进一步通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用仪进行结构分析，简述如下:取3.0g层析硅胶在110℃的温度下活化4h后，填充到玻璃层析柱中(顶部加入1cm无水硫酸钠)，取0.05~0.1g粗产品溶于2 mL乙酸乙酯/甲醇(10∶1，体积比)混合溶剂中，用40 mL上述混合溶剂洗脱，再通过旋转蒸发仪除去有机相得到槐糖脂纯化品。采用高效液相色谱-高分辨串联质谱联用仪(1290 HPLC-BrukermaXis Q-TOF美国Agilent公司)测定纯化品槐糖脂同系物的组分，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH130C182.1mm×150 mm×1.7μm。实验条件:流动相A:V(甲酸)∶V(乙腈)∶V(水)=0.1∶1.0∶99.0;流动相B:V(甲酸)∶V(乙腈)=0.1∶100.0;流速为0.2 mL/min。等度洗脱条件为:流动相B的体积分数为80%。柱温:30℃，进样量:1μL，UV检测波长:207nm，无分流进入质谱。质谱条件:电喷雾正离子模式;扫描范围m/Z:200~1000;毛细管电压:4.5kV;喷雾气压10342.5 Pa;干燥气(N2)流速:6L/min;气体温度:80℃;分辨率:50000。

1.2.5菌体细胞电子显微镜观察

通过透射电子显微镜(TEM)观察不同培养阶段S.bombicola细胞结构的变化。在培养第1天和第10天时分别移取添加原油浓度为0.5%的发酵液约10mL，在3500r·min-1，4℃条件下离心15 min后收集菌体。依次用2.5%的戊二醛和1%的四氧化锇固定，30%~100%的乙醇系列脱水，然后用环氧树脂包埋，切片，经醋酸铀，柠檬酸铅双染色后用TEM观察结构变化。

2结果与讨论

2.1菌株O-13-1对采油废水中石油烃的降解作用

在10d的降解时间内，接种S.bombicola的降解体系中油污染物被充分乳化分散为小油珠，培养液颜色明显加深，而未接种O-13-1菌株的对照培养体系原油仍呈块状漂浮于培养液表面。图1表示不同初始油浓度下经10d降解后的剩余原油量和原油降解率，结果表明，在10d的降解时间内，与空白对照相比，油浓度为0.3%、0.5%和0.8%的废水中油污染物降解率分别提高了18.0%、16.9%和11.9%，这表明所接种的S.bombicola菌株对废水中原油有明显的强化降解作用，且随废水中油浓度的降低，生物降解率逐渐提高，这与Rahman等的研究结果基本一致。这可能是由于油浓度过高，对降解菌细胞具有一定的毒性，降解菌需要较长的时间适应调整。

正构烷烃的中等碳数(C17—C28)组分降解率变化趋势如图2所示。接种S.bombicola的培养体系中各组分下降明显。油浓度为0.8%、0.5%和0.3%的降解体系中正构烷烃降解率分别为7.0%~12.8%、17.9%~44.0%和4.5%~27.7%，表明S.bombicola可对原油中正构烷烃组分进行生物降解。实际上，已有研究表明，S.bombicola可高效降解石油烃中的烷烃类组分。在降解过程中，原油首先被吸附于菌细胞表面。

图1不同初始油浓度下经10d培养后剩余原油含量和原油降解率的变化

图2油浓度为0.8%(a)、0.5%(b)和0.3%(c)的培养体系中正构烷烃的中等碳数组分降解率