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两种抗菌肽与生物膜之间的相互作用的比较——摘要、介绍、材料和方法

来源:上海谓载 浏览 40 次 发布时间:2022-01-12

摘要


研究了两种抗菌肽magainin 2和indolicidin与三种不同模型生物膜的相互作用,即单层膜、大单层囊泡(luv)和巨大脂质体。当1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SOPC)膜中的酸性磷脂1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)的含量增加时,两种肽插入脂质单层的能力逐渐增强。吲哚青霉素和马盖宁2也渗透到含有胆固醇的脂质单层中(摩尔分数,X=0.1)。通过含芘脂肪酸的磷脂衍生物1-棕榈酰-2-[10-(芘-1-基)癸酰基]-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油(PPDPG)的准分子/单体荧光比Ie/Im的降低,揭示了magainin 2的膜结合减弱了含POPG的LUV中的脂质侧向扩散。同样,观察到含有二苯基己三烯(DPH)的膜的稳态荧光各向异性增加,揭示了magainin 2增加酰基链顺序并诱导酸性磷脂分离。吲哚西丁也有类似的作用。用光学显微镜观察了magainin2和吲哚青霉素对磷脂膜的拓扑效应。Magainin 2对SOPC或SOPC:胆固醇(X=0.1)巨型脂质体基本没有影响。然而,当酸性磷脂(XPG=0.1)包含在巨大囊泡中时,观察到有效的囊泡形成。吲哚西丁只引起巨大SOPC囊泡的轻微收缩,而当巨大脂质体含有POPG(XPG=0.1)时,观察到内吞囊泡的形成。有趣的是,对于吲哚肽,由SOPC/胆固醇(Xchol=0.1)组成的巨大囊泡也可观察到囊泡形成。讨论了这两种多肽诱导细胞膜转化的可能机制。


介绍


在过去十年中,在动植物和细菌中发现了越来越多的抗菌肽,如天蚕素、防御素、马盖宁、蜂毒素、吲哚青霉素和阿拉米霉素。这些肽在脊椎动物和无脊椎动物中用于进攻和防御目的(Sansom,1991;Saberwal和Nagaraj,1994;Matsuzaki,1998),通过与脂质相互作用,以某种方式干扰靶细胞膜的屏障特性(Bechinger,1997;Matsuzaki,1998,1999;Oren和Shai,1998;Shai,1999;Sitaram和Nagaraj,1999)。作为阳离子,抗菌肽优先与细菌中特别丰富的酸性脂质相互作用(Op den Kamp,1979),从而为细胞特异性的差异提供了基础(Matsuzaki等人,1995a)。上述特性使这些肽成为研究脂质-蛋白质相互作用的一个有趣领域,并可能进一步开发新的抗菌、抗癌和抗病毒化合物。


我们在这里报告了两种抗菌肽,马盖宁2和吲哚青霉素与脂膜相互作用的比较。Magainin和indolicidin根据其氨基酸组成和二级结构属于不同的抗菌肽家族(Falla等人,1996年)。因此,magainin是类脂膜中呈现两亲性=-螺旋结构的一个范例(Matsuzaki,1999),而吲哚肽属于另一个类脂双层中具有独特氨基酸组成和非α-螺旋构象的类脂(Ladokhin et al.,1999;Ha et al.,2000)。在非洲爪蟾爪蟾的皮肤中发现了Magainins,并在非溶血浓度下显示出广谱抗菌(Zasloff,1987;Zasloff等人,1988)和抗癌细胞活性(Crucani等人,1991;Baker等人,1993)。为此,有兴趣的青蛙皮肤提取物已被用于中医药中的皮肤感染的控制(L.Miao,罗斯基勒大学,个人通信,2000)。Magainin 2由23个氨基酸残基(GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS)组成,具有4的正净电荷,并通过渗透细菌膜发挥其抗菌活性(Matsuzaki等人,1997年)。已经提出形成肽-脂质超分子复合物孔,允许离子、脂质和肽的跨双层运输,同时跨膜电位和脂质不对称性的耗散(Matsuzaki et al.,1995a,b,c,1996,1998;Ludtke et al.,1996)。magainin对亚微观脂质囊泡作用的光谱和动力学研究(Matsuzaki等人,1995a,b,c,1996,1998;Ludtke等人,1996)揭示了相互作用的协同性质。然而,magainin对膜扰动的确切机制仍存在争议。


吲哚青霉素存在于牛中性粒细胞的细胞质颗粒中(Selsted等人,1992年),具有独特的氨基酸组成,其13个氨基酸序列中有5个Trp和3个Pro残基(ILPWR)。它是最短的天然线性抗菌肽之一,与magainin类似,对革兰氏阴性和阳性细菌(Selsted et al.,1992)和真菌(Ahmad et al.,1995)以及原生动物(Aley et al.,1994)具有活性。吲哚西丁对大鼠和人T淋巴细胞也有细胞毒性(Schluesener等人,1993年),分解红细胞(Ahmad等人,1995年),并具有抗HIV-1的活性(Robinson等人,1998年)。吲哚肽优先与酸性磷脂结合,尽管它也与中性磷脂结合(Ladokhin等人,1997)。已证明吲哚青霉素可渗透大肠杆菌外膜(Falla等人,1996年;Subbalakshmi等人,1996年),形成通道,如平面双层电导测量所示(Falla等人,1996年;Wu等人,1999年)。吲哚西丁对细胞膜的高亲和力、不寻常的氨基酸组成和小体积使其成为一种有趣的抗菌剂。其抗菌活性、电荷要求以及Trp和Pro残基对生物活性的重要性已被广泛研究(Sitaram和Nagaraj,1999)。然而,肽介导的细胞裂解的分子机制,即肽是否形成孔隙、像洗涤剂一样溶解膜或诱导膜缺陷,仍然存在争议(Sitaram和Nagaraj,1999)。


小的和大的单层囊泡(LUV)继续被广泛用作模型膜。然而,这些脂质体是亚微观的,不允许分辨与生物膜更宏观变化相关的形态学特征。所谓的巨大囊泡(10–500 m)是一种球形、封闭的分子双层结构,它能包裹一个水室,是研究波动、萌芽、损伤和愈合的良好模型,以及膜作用试剂诱导的细胞样行为的其他表现(Riquelme等人,1990年;Menger,1998年;Menger和Lee,1995年;Menger和Keiper,1998年;Angelova和Tsoneva,1999年;Angelova等人,1999年;Holopainen等人,2000年)。由于巨大的囊泡体积大,可以通过光学显微镜观察到,从而可以直接可视化涉及超分子化学和生物物理学的过程(Luisi和Walde,2000)。在这项研究中,我们分别使用不同的膜模型,即单层膜、大的单层囊泡和巨大的脂质体,来研究马加宁和吲哚西定在膜中的渗透,它们对双层脂质动力学的影响,以及膜的宏观形态变化。


材料和方法


材料


Hepes、EDTA和magainin 2来自西格玛(密苏里州圣路易斯),吲哚西丁来自巴切姆(瑞士布本多夫)。经各自供应商提供的高效液相色谱分析验证,肽的纯度分别>99%和>95%。通过质谱证实了马盖宁2和吲哚青霉素的正确分子量和纯度。1-硬脂酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(SOPC)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)和>-胆固醇来自Avanti极性脂质(Alabaster,AL)。对于荧光磷脂类似物,1-棕榈酰-2-[10-(芘-1-基)癸酰]-sn-甘油-3-磷酸-rac-甘油(PPDPG)和1-棕榈酰-2-[10-(芘-1-基)癸酰]-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PPDPC)来自K&V Bioware(芬兰埃斯波)。二苯基己三烯(DPH)来自EGA Chemie(Steinheim,德国)。使用高精度电子天平(Cahn,Cerritos,CA)通过重量法测定未标记脂质的浓度,并使用摩尔消光系数分别为38000 cm-1和88000 cm-1,通过341 nm处的吸光度法测定含芘磷脂和DPH的浓度。脂质的纯度通过薄层色谱法在使用氯仿/甲醇/水(65:25:4,v/v/v)开发的硅酸涂层板(德国达姆施塔特默克公司)上进行检查。碘染色后以及适当情况下,紫外线照射后对平板进行检查,未发现任何杂质。


肽在脂质单层中的渗透


使用磁搅拌环形聚四氟乙烯孔(多孔板,亚相体积1.2 ml,芬兰赫尔辛基基布隆)测量肽对单分子脂质膜的渗透。表面压力(π)通过连接到连接到奔腾PC的微量天平(Delta-Pi,Kibron)上的Wilhelmy线进行监测。将脂质在氯仿(~1 mg/ml)中以指定的摩尔比混合,然后在该溶剂中扩散到空气缓冲(5 mM Hepes,0.1 mM EDTA,pH 7.0)界面上。随后,在向亚相注入马盖宁2或吲哚青霉素之前,让脂质单层在不同初始表面压力(π0)下平衡约15分钟。肽的最终浓度为1m。注射肽后的增量π在约30min内完成,初始表面压力(π0)与肽渗透到膜中后观察到的值之间的差值取为∆π.所示数据表示三次测量的平均值,表示为∆π对π0。所有测量均在环境温度(~24°C)下进行。


LUV的制备


指示的脂质在氯仿中混合,然后在氮气流下去除溶剂,随后在减压下保持脂质残余至少2小时。然后在50°C下水合干燥脂质,以产生1 mM的脂质浓度。使用Lipsofast低压均质器(加拿大渥太华Avestin)通过两个聚碳酸酯过滤器(孔径100 nm,微孔,贝德福德,马萨诸塞州)的堆叠挤出所得分散体,以获得LUV。


Ie/Im的测量


芘是准分子形成有机荧光团的典范,其衍生物在生物分子研究中得到了广泛的应用。单体芘发射波长约为398nm的荧光,准分子(激发二聚体)通过发射波长约为480nm的荧光松弛回到两个基态芘。稳态Ie/Im值为探针碰撞频率的质量变化提供了一个相当好的度量,反映了芘标记脂质的横向扩散和局部浓度(简要回顾,见Kinnunen等人,1993年;Duportail和Lianos,1996年)。使用Perkin Elmer LS50B荧光光谱仪和磁搅拌恒温反应杯室,使用344 nm的激发波长测量用PPDPG或PPDPC(X=0.01)标记的LUV的荧光发射光谱。激发和发射均使用5nm的带宽。使用的脂质浓度为25 M,温度保持在25°C。添加适量肽后,在记录光谱之前,样品平衡5分钟。取三次扫描的平均值,分别在~398和480 nm处测量Im和Ie的发射强度。所有测量重复三次。


DPH的荧光各向异性


DPH以X=0.002加入脂质体中。使用的脂质浓度为25m,温度保持在25°C。使用带有Perkin Elmer LS50B的宝丽来型滤光片以L格式测量偏振发射。使用5αnm带宽,在360 nm激发和450 nm发射下测量DPH的荧光各向异性r,并使用Perkin Elmer提供的软件程序计算其值。所有测量重复三次。


巨大脂质体的形成


如其他地方所述制备巨型脂质体(Angelova和Dimitrov,1986;Holopainen等人,2000)。简单地说,将约1–3 l溶解在二乙醚:甲醇(9:1,v/v,最终总脂质浓度1 mM)中的所需脂质摊铺在两个铂电极的表面上,随后在氮气流下干燥。在真空中抽空1小时,去除可能残留的有机溶剂。在蔡司IM-35倒置荧光显微镜的工作台上放置一个带有附加电极和石英窗口底部的玻璃室。在添加1.3 ml pH值为7.4的0.5 mM Hepes缓冲液之前,施加交流磁场(频率为4 Hz,振幅为0.2 V的正弦波函数)。在水合作用的第一分钟内,电压增加到1.0–1.2 V。2–4小时后关闭交流电场,并使用Hoffman调制对比度(HMC)光学系统和10/0.25物镜观察巨大脂质体(调制光学系统,纽约州纽约)。巨型脂质体的大小通过微移液管的运动校准图像,作为微操作器(MX831,带MC2000控制器,SD Instruments,Grants Pass,Oregon)步长(50 nm)的适当倍数来测量。使用帕尔贴冷却12位数字CCD摄像机(C4742-95,日本滨松市滨松)记录图像,该摄像机与计算机连接,并由制造商提供的软件(HiPic 5.0.1)操作。


微量注射技术


用微处理器控制的水平拉拔器(P-87,Sutter Instrument Co.,加利福尼亚州诺瓦托)用硼硅酸盐毛细管(外径1.2-mm)制成内径>0.5 m的微量移液管(Schnorf et al.,1994)。指示量的肽溶液(10mmHEPES中的0.5mm,0.1mmEDTA,pH 7.0)以气动微注射器(PLI-100,医疗系统公司,纽约州格林维尔)输送的一系列单次注射~20FL的形式应用于单个巨大囊泡的外表面。为便于操作,仅使用附着在电极表面的囊泡。所有实验均在环境温度(~24°C)下进行,并重复至少10次。