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膜分析仪应用:胆固醇对 hBest1/POPC 和 hBest1/SM Langmuir 单分子层的

来源: 浏览 88 次 发布时间:2024-06-03

Bestrophin-1(hBest1)是一种跨膜蛋白,在视网膜色素上皮(RPE)细胞和神经元细胞的基底外侧膜上表达。hBest1的主要功能之一是氯离子的钙依赖性运输。它还被认为在中枢神经系统中发挥通道作用,参与神经胶质细胞中γ-氨基丁酸(GABA)和星形胶质细胞和神经元中谷氨酸(Glu)的转运。BEST1基因的突变(表现在合成的蛋白质中)是导致视网膜疾病发展的原因,称为Bestrophinopathies。关于hBest1与不同细胞膜脂质的分子相互作用的科学数据不足以阐明蛋白质的功能活性,尤其是与胆固醇(Chol),它在“经典”脂筏的形成中起关键作用。胆固醇的主要物理化学性质之一是其凝聚作用。Chol与卵磷脂的相互作用导致脂肪酸烃残基的构象变化和“干扰”减少,它们的方向转向分子的中心轴,自由体积和横截面减少,以及在不改变表面压力的情况下被分子占据的区域。当与某些类型的多不饱和磷脂相互作用时,胆固醇没有凝聚作用。


在这项研究中,特别关注Chol与hBest1在纯和复合蛋白质-脂质模型系统中的相互作用。使用朗缪尔单层膜进行表面压力测量和布鲁斯特角显微镜成像,我们证明了Chol对纯hBest1单层膜的凝聚效应可以忽略不计,在Ca 2+离子存在下会变得更高。


Kibron膜分析仪的的应用


PTFE涂层的不锈钢多孔板(孔容量0.5 mL)和Wilhelmy测力探头的Langmuir天平(Kibron Inc)在相同的实验条件下进行实验,温度为35±2°C。单层在含有150 mM NaCl(pH~7)的亚相上形成,添加和不添加0.5μM CaCl 2。将单层的成分连续应用于界面.首先将POPC或鸡蛋SM(氯仿中的1 mM储备溶液)涂抹至表面压力π达到20 mN/m,然后添加Chol(氯仿中的0.1 mM储备溶液)2分钟后,摩尔分数X Chol0.167 0.285、0.375、0.444或0.5。再过2分钟后,当溶剂蒸发且π达到恒定值时,将hBest1(在150 mM NaCl中的1 mg/mL储备溶液)添加到二元POPC/Chol或SM/Chol单分子层中。扩散hBest1的体积是相对于系统中的主要脂质(POPC或SM)计算的,摩尔比分别为1:45和1:86,因此蛋白质所占的面积与周围脂质所占的面积为1:3。在将hBest1应用到界面上10分钟后进行测量。每个实验至少进行七次.


实验结果


单分子层膜中胆固醇的浓度会影响膜蛋白的许多物理化学、生化和生物物理特性。对于Na+K+ATPase——Chol浓度显示出调节作用——在膜中低至中等水平的胆固醇(胆固醇:磷脂的比例从1:4到1:2)时,活性增加,而在较高水平胆固醇浓度(胆固醇:磷脂比,1:1)酶活性降低。视紫红质的功能还取决于胆固醇的存在。高浓度的胆固醇导致层增厚和视紫红质无法改变其构象,这是其功能所必需的。研究结果证明了胆固醇对hBest1和复合hBest1薄膜的凝聚作用。在POPC/Chol/hBest1和SM/Chol/hBest1三元单分子层中,冷凝效应发生在不同胆固醇浓度下。这也表明Ca 2+离子在胆固醇凝聚效应中起关键作用——对于hBest1/Chol和hBest1/SM/Chol单分子层非常明显。

图1.胆固醇对(A)hBest1、(B)hBest1/POPC、(C)hBest1/SM、(D)POPC和(E)SM单分子层的凝聚效应(Chol的摩尔分数为0.167;0.285;0.375;0.444和0.5)在存在或不存在Ca 2+的情况下,在35±2°C。数据表示为平均值±SE,n=7。

图2.(A)hBest1/Chol单分子层、(B)hBest1/POPC/Chol(C)hBest1/SM/Chol单分子层的BAM图像(摩尔分数为Chol 0.167;0.285;0.375;0.444和0.5)Ca 2+的存在与否,在35±2°C。白色比例尺=100µm。

图3、(A)POPC/Chol单层膜,(B)SM/Chol单层膜的BAM图像(Chol摩尔比为0.167;0.285;0.375;0.444和0.5),存在或不存在Ca2+,在35±2°C。白色比例尺=100ϻm。


总结


bestrophin-1蛋白(hBest1)是一种跨膜通道,与视网膜色素上皮中氯离子的钙依赖性转运以及神经细胞中谷氨酸和GABA的转运有关。hBest1、鞘磷脂、磷脂酰胆碱和胆固醇之间的相互作用对于hBest1与细胞膜结构域及其生物学功能的关联至关重要。由于胆固醇在脂筏的形成、脂质的运动排序和侧膜结构的建模/重塑中起关键作用,研究人员应用LB单分子层膜技术(Kibron膜分析仪)检查了不同胆固醇浓度对hBest1/POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)和hBest1/SM Langmuir单分子层在存在/不存在Ca 2+的情况下离子使用表面压力测量和布鲁斯特角显微镜研究。研究人员使用朗缪尔单层膜(Kibron)进行表面压力测量和布鲁斯特角显微镜成像,研究证明了Chol对纯hBest1单层膜的凝聚效应可以忽略不计,在Ca 2+离子存在下会变得更高。在不存在Ca 2+的情况下,Chol对复合hBest1/POPC和hBest1/SM单分子层也表现出显着的凝聚效应,在添加Ca 2+离子后会有所不同。研究结果揭示了表面单层平面中hBest1分子的组织和结构构象的Chol作用,以了解蛋白质与细胞膜结构域的关联,这一过程可能会影响其生物学功能。