2结果与讨论

2.1生物表面活性剂产生菌的筛选和鉴定

经过血平板初筛得到25株菌株，表1是表面张力仪复筛结果。可以发现147号细菌发酵液的张力值明显低于其他菌株，选择147细菌作为目标菌株。

观察菌株培养特征及形态特征，可见菌体细长且长短不一，菌落较小，为扁平、湿润的菌落。部分生理生化指标如表2。经16S rDNA测试并与GenBank中已登录的核苷酸序列号进行同源性比较，发现菌株147与Pseudomonas aeruginosa DSM50071同源性为99%，采用MEGA 5.10软件NJ方法构建147的16S rDNA系统发育树见图1。结合生理生化特征结果，将菌株147鉴定为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），该菌株GenBank登录号为KU921686。

表1细菌复筛结果

表2 147菌株的生理生化特性

2.2147细菌产生表面活性剂的物质结构鉴定

通过薄层色谱分析显示，苯酚-硫酸试剂有棕色斑点，加入茚三酮显色剂则无明显变化。这说明该菌株主要产糖脂类生物表面活性剂，不产生或者产生少量的脂肽类物质。

将菌株147产物提纯，红外光谱仪（FT-IR）分析物质结构，结果如图2。该物质在3701.72cm-1处有吸收峰，表明分子中有羟基存在；2 858.77～2 927.56 cm-1处的吸收峰表明存在糖类C-H的伸缩振动，1400～1200 cm-1处是C-H变角振动，1 734.39 cm-1处是C=O的双键振动，而1 070.04 cm-1处为C-O-C键伸缩振动，因此该物质中有一个五元环状内酯和糖苷键存在。由此进一步证明该生物表面活性剂含糖脂类物质。

发酵产物临界胶束浓度是指分子在溶剂中缔合形成胶束的最低浓度。临界胶束浓度（Critical micelle0.005 concentration，CMC）可以作为表面活性剂表面活性的一种度量，CMC越小，改变表/界面性质，起到增溶、乳化等所需的浓度就越低。从图3可以看出：糖脂在0～300 mg·L-1时，表面张力值随着糖脂浓度的升高而降低，且在300 mg·L-1时达到最小值；在300～500 mg·L-1时，表面张力值变化不大。可得发酵粗提产物的CMC为300 mg·L-1，明显低于普通化学表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）的2200 mg·L-1，能在较低浓度下使用，因而在医药、食品、化工等行业具有广阔应用前景。

图1 147菌株16S rDNA基因序列系统发育树

图2 147菌株产的生物表面活性剂红外光谱图

图3不同浓度生物表面活性剂溶液的表面张力

2.3147细菌发酵条件优化

2.3.1碳源的影响

碳源对细菌的生长与发酵产物量有重要影响。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可在多种类型碳源下产生生物表面活性剂，包括甘油、乙醇、植物油等。由表3可知，以花生油为碳源，细菌发酵液的降低值为39.12 mN·m-1，明显高于其他碳源类型；乳化值为34.17%，稍高于其他碳源，此时细菌生物量最大，糖脂含量最高，为0.30 g·L-1。虽然花生油作为碳源，能够促进菌株产生更多生物表面活性剂，但如果用于实际生产，成本相对较高，近年来一些研究者尝试使用成本较低的工业副产物如糖蜜、废润滑油等作为碳源，发现也具有很好的促进微生物产生生物表面活性剂的作用。因此，后期会考虑选择用一些低成本碳源进行发酵。

2.3.2氮源的影响

细胞表面的物质合成需要氮源，氮源的种类会对细菌细胞的生长和发酵产物的产量产生很大影响。由表4可以看出，不同氮源对细菌发酵过程中表面张力降低值的影响较小，可能与发酵液中的生物表面活性剂含量已经达临界胶束浓度（CMC）有关。当氮源为硫酸铵时发酵液表面张力降低值最大，同时乳化性、细菌干重、糖脂含量均达到最大值。这与钱晓勇等研究结果一致，硫酸铵是促进生物表面活性剂生成的较好氮源。

表3碳源对147细菌生长以及生物表面活性剂产量的影响

表4氮源对147细菌生长以及生物表面活性剂产量的影响

2.3.3碳氮比的影响

由表5可以发现当碳氮比在5以上时，表面张力降低值与乳化性变化不大，而细菌干重与生物表面活性剂含量却明显不同，说明当碳氮比大于5时，该菌株生物表面活性剂产量已经超过临界胶束浓度。细菌干重在碳氮比为25时最大，为2.58±0.09 g·L-1，同时生物表面活性剂含量也达到最大，为1.74±0.01 g·L-1。这与Saimmai等研究结果一致，25是147菌株的最适生长碳氮比，此时细菌的生物量达到最高，生物表面活性剂产量也最高。