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应用单分子层技术分析磷脂酶与不同磷脂底物特异水解性能:结果和讨论、结论!

来源:上海谓载 浏览 182 次 发布时间:2022-02-14

3、结果和讨论


在表征脂肪酶对某些天然脂质的底物特异性时,最常用的方法是基于乳化反应体系,使用pH-stat法。虽然通过这种方法,我们可以得到酶对某些天然脂质底物的酶活性,并且可以满足酶对界面的需求,但反应对底物和酶的需求是丰富的,当底物或酶价格昂贵或不易获得时,不适合评估酶的活性。这种方法的另一个限制是,对于乳化体系,不可能控制“界面质量”,也不可能在恒定表面压力下跟踪脂肪酶的动力学行为[10]。据报道,表面压力可以通过横向密度的变化以及脂质组织和结构的变化影响脂质结构域的形成,最终影响脂肪酶的立体选择性、区域选择性和底物选择性[17-19]。因此,传统的pH-stat法对活性检测仍有一定的局限性。此外,由于不同天然磷脂标准品的价格非常昂贵,因此没有采用常规的活性测试方法。在此,使用小体积的酶和底物进行单层技术,并在反应过程中精确控制表面压力,选择单层技术来研究底物特异性。


图1显示了空气-水界面上不同磷脂单层的π-A曲线形状。这里测试的所有磷脂的π-A曲线的形状都是在所有显示的表面压力下单一液体膨胀(LE)和液体冷凝(LC)状态的特征。在压缩时,单层经历了一个转变,这被视为从LE(低于10 mN/m)到LC状态的转变。在高分子区域,由于分子堆积的增加,表面压力升高,但不改变单层膜的弹性。最后,单分子膜达到了一种更为浓缩的状态,但在π-a等温线的形状中没有明显的崩塌点。对于这里测试的磷脂,它们都可以形成稳定的膜,并表现出良好的压缩性能,DOPC的表面压力甚至达到57 mN/m。


在本研究中,为了获得商业酶对各种天然磷脂的底物选择性信息,并为实际应用提供经济指导,商业酶直接使用,无需进一步加工。此外,子阶段使用的缓冲液pH值调整为5.0,与油脱胶工业中使用的实际反应条件一致。基于上述π-A曲线,我们最终选择在10 mN/m到30 mN/m的表面压差下测试超乳糖酸酶对不同磷脂的活性。


图2示出了使用各种磷脂作为水解底物获得的详细活性-表面压力曲线。可以看出,酶的水解活性高度依赖于表面压力。然而,每种底物的活性曲线不同。发现基板PE、PS和CL的钟形曲线具有特征性的最佳表面压力值(图2B、D、E)。在低于15 mN/m的表面压力下,未检测到基本酶活性。水解活性随表面压力的增加而增加。在25 mN/m的表面压力下,观察到PE、PS和CL的最大活性。然而,当表面压力高于25 mN/m时,所有这些磷脂的水解活性降低。与所有测试的底物相比,在25 mN/m的表面压力下,PE的水解率最高,水解活性达到5272.31×10-11摩尔。cm-2。最小-1。mL-1。对于PI,在15 mN/m以下也没有观察到水解速率,但是,没有观察到钟形曲线,并且随着表面压力从15 mN/m增加到30 mN/m,活性增强(图2C)。对于PC,从10 mN/m到25 mN/m观察到钟形曲线,但在30 mN/m的表面压力下,活性进一步增加。随着表面压力从25 mN/m增加到30 mN/m,表面轮廓上的单层构象可能发生了变化,导致活性增加。在本实验中,在测试的表面压力范围内,SM没有活性。从π-A曲线可以看出,在25 mN/m的表面压力下测试的所有磷脂都处于液态冷凝状态,没有达到各自的坍塌压力。在这种情况下,超卵磷脂酶对不同单分子磷脂膜的偏好顺序为PE>CL>PS>PI>PC。在这些条件下,SM没有活性。Lecitase Ultra选择性的详细机制仍需阐明。


4、结论


利用单层技术,成功地表征了超乳糖酸酶对各种天然磷脂的底物特异性。在本研究中,除SM外,Lecitase Ultra对各种磷脂表现出广泛的选择性。在所有测试的磷脂中,观察到对两性磷脂PE的高度偏好。目前对Lecitase Ultra的研究为其底物选择性提供了第一手信息,并为在原油脱胶或磷脂转化过程中有效利用该酶提供了有利信息。


这项工作是由中国国家自然科学基金(31471690,31401627)、中国广东省科技计划(2013B0510000 09)和中国广州珀尔里弗科技计划(201610010074)提供的。作者声明没有利益冲突。


人物传说


图1不同磷脂的表面压力-面积等温线。

图2使用不同磷脂的卵磷脂酶超水解活性随表面压力的变化。在室温下,在零级槽中进行分析。缓冲液:50毫米柠檬酸缓冲液(pH值5.0)。活性表示为单位时间、单位反应室面积和“零级”槽中每毫升酶水解的底物摩尔数(摩尔数cm-2.min-1.mL-1)。