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基于朗缪尔张力仪研究抗菌肽与磷脂单层的相互作用

来源: 浏览 89 次 发布时间:2024-05-30

研究简介:抗生素耐药性(AMR)已成为传染病治疗的最大障碍,对人类健康构成严重威胁。预计到2050年,全球将有近1000万人死于抗药性细菌感染,与AMR相关的全球经济损失将达100万亿美元。因此开发能够克服AMR的新型抗菌药物至关重要。抗菌肽(AMP)的出现为治疗耐药菌提供了另一种方法。AMPs或宿主防御肽(HDPs)具有强效和广谱的抗菌活性,也适用于抗生素耐药细菌。与传统抗生素不同,AMPs通过穿透和破坏细菌细胞膜发挥其抗菌作用,这是一种进化的宿主防御机制。抗菌肽(AMP)或宿主防御肽通过穿透和破坏细菌膜起作用,因此与传统抗生素相比,不易产生抗菌素耐药性(AMR)。然而,天然存在的AMPs在临床应用中仍然存在许多挑战,需要进一步研究以确定AMPs的化学结构与其抗菌活性和选择性之间的关系。研究人员设计了一系列的AMP衍生自Ponericin-W1(一种来自蚂蚁的天然AMP)的化学结构与生物活性之间关系的研究。通过以系统方式修饰前导肽序列的疏水和亲水区域来设计抗菌肽。代表性肽At5的抗菌活性也在皮肤伤口感染的小鼠模型中进行了测试。研究了肽的物理化学性质与其抗菌活性之间的关系。用疏水氨基酸取代肽疏水区的阳离子氨基酸增强了它们的抗菌活性,增加亲水区阳离子氨基酸的数量降低了它们对人红细胞的毒性,从而提高了它们对细菌的选择性。


Kibron朗缪尔张力仪的应用


使用4 mL内置槽的DeltaPi朗缪尔张力仪(Kibron),研究了肽与磷脂单层的相互作用作为细菌和哺乳动物细胞膜的体外模型。用4 mL去离子水填充槽,并通过使用Hamilton微注射器将DPPC或DPPG在氯仿(0.2 mg mL-1)中的溶液铺展在水面形成脂质单层。氯仿蒸发后,在空气-水界面形成脂质单分子层。在最终浓度为10μM的脂质单层下注射抗菌肽溶液后,通过监测脂质单层表面压力的变化(从28 mN m-1的起始压力)来研究肽与脂质单层的相互作用。


实验结果


研究了基于源自天然蚂蚁AMP Ponericin-W1的15个氨基酸序列设计了11个新序列(At2-At12)。通过分子设计和抗菌实验发现,用疏水残基取代疏水区的阳离子氨基酸残基增强了多肽的疏水性和抗菌作用。增加亲水区阳离子氨基酸残基的数量可降低肽对人红细胞的毒性,并增加肽对细菌的选择性。在这一系列肽中,At3、At5、At8和At10对细菌的选择性高于哺乳动物宿主细胞,通过抗菌测定和溶血活性测试显示。设计的肽对G−细菌多于G+细菌。扫描电镜和荧光显微镜显示肽的杀菌作用的主要机制是通过膜破坏。被认为是通过肽与细菌细胞膜中的脂质或LPS/LTA之间的静电和疏水相互作用的组合来发挥的。通过分子设计和抗菌实验发现,用疏水残基取代疏水区的阳离子氨基酸残基增强了多肽的疏水性和抗菌作用。增加亲水区阳离子氨基酸残基的数量可降低肽对人红细胞的毒性,并增加肽对细菌的选择性。

图1、用于确定(A)大肠杆菌和(B)金黄色葡萄球菌中肽的最低杀菌浓度(MBC)值的细菌培养物。

图2、设计肽的二级结构和溶血特性。(A)水、(B)25 mM SDS、(C)两性离子DPPC SUV(0.25 mg mL-1)和(D)带负电荷的DPPG SUV(0.25 mg mL-1)中肽的CD光谱。所有四种肽(At3、At5、At8、At10)在水和DPPC SUV中均呈现无规卷曲结构,而在SDS和DPPG SUV中均采用螺旋结构。肽浓度固定在0.1 mM。所有测量均在室温下进行。(E)DPPC和DPPG SUV中肽的α-螺旋含量。(F)肽的溶血活性。用不同浓度的肽处理人红细胞(hRBC)并在37°C下孵育1小时。然后在OD540nm处测量吸光度。

图3、设计的抗菌肽的疏水性由它们的HPLC保留时间确定,与它们对不同菌株(A)大肠杆菌、(B)铜绿假单胞菌、(C)金黄色葡萄球菌和(D)大肠杆菌的抗菌活性之间的关系。

图4、(A和C)在亚相中注射抗菌肽后DPPC和DPPG脂质单层的表面压力变化。(B和D)分别在注射抗菌肽(AMP)后DPPC和DPPG脂质单层表面压力的增加与DPPC和DPPG中AMP的螺旋度之间的相关性。注射抗菌肽后两性离子DPPC脂质单层表面压力的增加非常小,而阴离子DPPG脂质单层表面压力的增加相当高。

图5、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在37°C下用不同浓度的At5肽处理2小时前后的活/死染色(×100放大倍数,比例尺=10μm)。


结论与展望


本论文设计了11种新的AMP(At2–At12,方案1)是使用从蚂蚁中发现的天然存在的AMP Ponericin-W1(At1)中提取的15个氨基酸序列作为设计模板进行设计的。系统研究了氨基酸类型、疏水性和亲水性氨基酸的比例和位置、肽电荷密度和二级结构对AMPs对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌抗菌性能的影响。测定了肽的物理化学性质,例如疏水性和表面活性,并评估了它们的溶血活性和AMR对设计的AMP的发展。所提出的基于天然抗菌肽的分子设计策略可以为开发具有增强抗菌活性和减少AMR机会的新AMP提供强大的工具。本研究的结果可以更好地理解AMP的选择性抗菌活性所需的结构特征,并可作为开发具有增强生物学特性的新AMP的指南。未来的研究将针对结构修饰,以赋予肽更高的抗G+细菌抗菌活性,从而拓宽这些肽的抗菌活性谱。


芬兰Kibron朗缪尔张力仪可监测单分子层上的酶的作用;蛋白质的二维结晶;测量药物、肽/蛋白质与磷脂单分子层的特殊相互作用;核酸(DNA、siRNA)和阳离子脂质体的络合物生成。用于检测药物、肽/蛋白质和核酸对于特定磷脂构成单分子层的结合和穿透,精确控制磷脂单分子膜的横向堆积密度。磁力搅拌样品的体积最低为150微升,可确保材料消耗非常低。例如,1毫克抗菌肽足以全面描述其脂质结合特性。而且,材料的选择排除了多余的非特异性表面效应。