1材料与方法

1.1材料

试验菌株BD-2是以原油为唯一碳源从新疆克拉玛依石油污染土壤中分离的降解菌。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨5 g，酵母粉3 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，调pH至7.0。

1.2方法

1.2.1生物表面活性剂的提取

将菌株BD-2的发酵液于10 000 r/min，4℃离心20 min去除菌体，上清液用HCl调pH为2.0，4℃静置12 h，10 000 r/min，4℃离心30 min收集沉淀，将离心收集的沉淀溶解于无菌去离子水中，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0，冷冻干燥获得生物表面活性剂粗品。

1.2.2生物表面活性剂的表面活性测试

将菌株BD-2的发酵液于10 000 r/min，4℃条件下进行20 min的离心处理去除菌体，取一定量的发酵上清液进行排油圈、表面张力和乳化指数(E24)的测定，每个处理重复3次。

1.2.3发酵时间对菌株BD-2产表面活性剂的影响

将菌株BD-2制备成菌悬液，接种于发酵培养基中，于30℃，120 r/min培养，每12 h测定其菌落数、表面活性剂量和表面张力，每个处理重复3次。

1.2.4培养基的优化

（1）碳、氮源影响。将1%的菌株BD-2菌悬液接种到含3%各种碳源（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、原油、矿物油）的发酵培养基中，于30℃，120 r/min培养24 h，每个处理重复3次，测定表面活性剂量和表面张力，确定最适碳源。以尿素、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵作为氮源，将1%的菌株BD-2菌悬液接种到含各种氮源（0.15%）的发酵培养基中，于30℃，120 r/min培养24 h，每个处理重复3次，测定表面活性剂量和表面张力，确定最适氮源。

（2）金属离子的影响。向优化后的碳氮源种子培养基中分别加入硫酸锰和硫酸亚铁，使培养基中Mn2+和Fe2+的浓度分别为0、0.2、0.5、1和2 g/L，于120 r/min，30℃培养24 h，每个处理重复3次，测定表面活性剂量和表面张力。

1.2.5发酵条件的优化

在最佳碳源和氮源的基础上，将1%的菌株BD-2的菌悬液，接入发酵培养基，分别调节初始pH（5~9），温度（10~40℃）和盐浓度（0%~7%），每个处理重复3次，通过测定表面活性剂量和发酵液表面张力，进一步优化发酵过程的环境条件。

1.2.6生物表面活性剂稳定性研究

在优化发酵条件下，将菌株培养24 h，去除发酵液中的菌体，分别调节上清液pH（3~12），温度（10~100℃），盐度（0%~20%），静置2 h后，通过测定发酵液表面张力和萘的溶解度评价表面活性剂的稳定性，每个处理重复3次。

1.3数据处理

试验数据采用SPSS 21.0进行统计分析以及显著性检验，利用Origin 2021作图。