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Delta-8 动物胃肠道体内中药物的溶解度的测定——材料和方法

来源:上海谓载 浏览 754 次 发布时间:2021-11-26

材料和方法


材料


美沙拉秦(也称为美沙拉秦或5-ASA,水溶性1.32 mg/ml,[11]log P 0.98[13])来自Sigma-Aldrich(英国多塞特),泼尼松龙(log P 1.59[14])来自塞文生物技术有限公司(英国伍斯特郡)。水、甲醇、不含过氧化氢的四氢呋喃和三氟乙酸从Fisher Scientific(英国拉夫伯勒)购买,为HPLC级。缓冲容量测定用NaOH和HCl的容量标准从Sigma-Aldrich处获得。


胃肠组织


所有程序均由内政部批准(PPL编号70/6421),并根据英国1986年《动物(科学程序)法》进行。猪的胃肠道是在切勒肉类有限公司(英国埃塞克斯)的屠宰场从新鲜杀死的雄性动物(大白种和长白种杂交,n=3,95–110千克,6个月)获得的。成年新西兰大白兔(n=6,2.1-2.3 kg,9-10周)和Wistar大鼠(n=8220-255 g,8周)购自英国哈兰有限公司(英国牛津郡)。所有动物都可以自由饮水,并在处死前自由进食:兔子,实验室饮食5322,添加维生素C(英国诺丁汉郡IPS);猪,Eltabreed Bingle母猪蛋糕-猪用复合饲料(ABN有限公司,英国彼得伯勒);大鼠,Teklad全球18%蛋白质啮齿动物饮食(哈兰有限公司)。


胃肠液


所有测量均在从动物胃肠液中获得的上清液上进行。处死动物,将胃肠道分为胃、小肠、盲肠和结肠。如前所述,进一步细分小肠和结肠。[6,12]将胃肠液转移到适当的容器中,然后以13200 rpm的转速离心(德国汉堡Eppendorf AG 5415D离心机)(∼16 110×g rcf)保存20分钟。上清液在–80°C下保存,直至分析。由于大鼠胃肠道的液体容量有限,根据解剖位置收集了8只大鼠的液体,包括胃、小肠(近端、中部和远端)、盲肠和结肠。这些液体的缓冲容量、渗透压和表面张力的特征如下所述。还测定了药物在这些液体中的溶解度。所有测量均以一式三份进行。由于来自大鼠的液体的汇集性质,所述标准偏差代表分析变异性;然而,对于兔子和猪来说,它代表了动物间的变异性。


渗透压


使用数字微渗透计(5R型)(德国柏林Hermann Roebling Messtechnik)测定胃肠液上清液的渗透压,其中渗透压是利用冰点降低理论测量的。每次测量使用100μl的体积。


表面张力


使用Delta-8管理软件(版本3.8)控制的Delta 8张力计(芬兰埃斯波Kibron公司)测量表面张力。使用DynePlates(为张力计设计的96孔板)进行测量,每个孔中有50μl上清液。


pH值和缓冲容量


使用配有FC202电极的pH计(HI99161)测量GI上清液的pH值和缓冲容量,该电极用于测量粘性和半固体材料(Hannah Instruments,Bedfordshire,UK)。在pH值变化为0.5和1.0单位时,通过向胃肠液中的300μl上清液样品中添加小份HCl(用于肠液)或NaOH(用于胃液)来测量缓冲液容量,以达到所需的pH值变化。然后使用以下方程式计算缓冲容量:

式中,Ma是酸的摩尔浓度,Va是酸的体积(单位:毫升),Vb是缓冲液的体积(单位:毫升),ΔpH是pH单位的变化。


溶解度研究


样品处理和溶解度测量


过量的毒品(∼20毫克强的松龙或∼将15mg美沙拉秦)添加到含有200μl胃肠液上清液的微离心管(Eppendorf AG)中。然后将样品置于振荡浴(英国拉夫伯勒加伦坎普)中,温度保持在37°C,转速为170 rpm。24小时后,以5000 rpm的转速离心样品(∼4472×g rcf)在37°C下放置10分钟(离心机5804R,Eppendorf AG)。将上清液依次转移至离心过滤管(康宁Spin-X,0.22μm醋酸纤维素膜,从英国莱斯特郡费希尔科学公司获得),然后以5000 rpm离心(∼4472×g rcf)在37°C下放置20分钟(离心机5804R,Eppendorf AG)。在分析之前,取下等份滤液(50μl)并用1950μl流动相稀释。该方法之前已经过验证[11],以避免药物在生物液体中降解或与过滤器结合而影响溶解度结果。


分析方法


使用先前报告的方法,通过配备紫外线检测器(安捷伦科技1200系列,加利福尼亚州圣克拉拉)的反相高效液相色谱法测定样品中溶解的泼尼松龙或美沙拉秦的量。[11]空白胃肠液样品(来自“样品处理和溶解度测量”部分的无药物上清液)也以与测试溶解度的样品相同的方式分析,以排除在药物保留时间出现干扰峰的可能性。空白样品以与样品相同的方式稀释,过滤并随后分析。色谱条件为:流动相(5%甲醇,95%水加0.05%三氟乙酸用于美沙拉秦,68.8%水,25%四氢呋喃和6.2%甲醇用于泼尼松龙);反相柱,水对称性C8 5μm 4.6×250mm(美国马萨诸塞州米尔福德沃特斯)用于泼尼松龙,5μm 250×4mm(德国达姆施塔特默克)用于美沙拉秦。美沙拉秦和泼尼松龙分别在228nm和254 nm处检测,保留时间分别为7.0和9.9分钟。两种药物的剩余分析条件相同(即:20μl注射量,124 bar和40°C柱温下的流速为1 ml/min)。


统计分析


总体数据通过单向方差分析进行分析,然后使用IBM SPSS Statistics 19(美国伊利诺伊州芝加哥SPSS Inc.)进行Tukey事后分析,置信区间为95%。使用一元一般线性模型工具,结合Tukey事后分析,将物种和位置作为固定因素,事后结果的统计显著性为P<0.05。

Delta-8 动物胃肠道体内中药物的溶解度的测定——摘要、介绍

Delta-8 动物胃肠道体内中药物的溶解度的测定——材料和方法

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Delta-8 动物胃肠道体内中药物的溶解度的测定——结论、致谢!