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人胰岛素的朗缪尔单分子层膜的表面化学和光谱学性质——实验部分

来源:上海谓载 浏览 161 次 发布时间:2021-11-29

2. 实验部分


2.1. 材料


纯重组人胰岛素、甲醇、氯仿和盐酸从MP Biomedical,LLC(Solon,OH)获得。 重组人胰岛素(Catalog#199744,99.3%分析)已在大肠杆菌表达系统中产生,并使用亲和纯化进行纯化。 所有化学品均为试剂级,使用时无需进一步纯化。 用于子阶段制备的水来自Modulab 2020水净化系统(德克萨斯州圣安东尼奥大陆水系统公司)。 纯化水的表面张力为72.6 mN·m − 1在20.0±0.5°C,电阻率为18 MΩ·cm,pH值为5.6时。


2.2. 方法


FITC人胰岛素结合程序。 通过FITC-HI的表观荧光检测HI-Langmuir单层的形貌。 由于胰岛素是非荧光的,所以必须附加一个荧光团才能使用荧光显微镜。 常用的蛋白质探针是异硫氰酸荧光素(FITC)。


FITC共轭HI的制备方法如下。 在PBS溶液中分别制备FITC(1 mg/mL)和HI(0.3 mg/mL)溶液。 用铝箔覆盖FITC溶液和任何含有FITC的溶液,以防止荧光探针的光降解。 将FITC溶液逐滴加入胰岛素溶液中并搅拌1小时。 这两种溶液在FITC与胰岛素的摩尔比为0.5:1至4:1的范围内相互混合。 搅拌后,溶液通过G-25 Sephadex柱(球状蛋白范围:1×103至5×103 Da)按以下顺序按重量分离:FITC-HI、HI和FITC。 当流经葡聚糖凝胶柱的其中一种组分的质量高于该范围时,这些组分将首先流出。 G-25葡聚糖凝胶的最大范围为5000da; 然而,HI的摩尔质量为5870 g mol − 1. 三个组成部分中有两个高于5000 Da,即HI-FITC和HI。 因此,最重的组分HI-FITC将首先流出色谱柱,然后流出HI。 最轻的成分是FITC和FITC碎片,它们保留在柱的顶部,如柱顶部的亮绿色发光所示。 柱上的紫外光显示三个不同区域:柱底部附近的荧光绿色区域,对应于FITC-HI,其上方的非荧光部分对应于未共轭于FITC的HI,以及柱顶部的荧光黄色区域,对应于未共轭于HI的FITC。 使用PBS缓冲液运行色谱柱,收集体积为1mL的等分试样。


荧光光谱法用于选择含有FITC-HI的小份样品。 FITC探针在494nm激发时显示出517nm的发射。 人们注意到,当探针与HI共轭时,FITC发射的强度增加。 吸收光谱法用于确定HI与FITC的比率,该比率由下式计算得出。21

其中MolWtHI=5870 g mol − 1和ε280,HI和ε495,FITC分别为17335和90000。 A495和A280分别是共轭物和HI在494和280 nm处的吸光度。 考虑到FITC在280 nm处的吸光度,校正系数为0.35×A495。 制备了各种共轭物(FITC x-HI),x代表每HI结合的FITC分子的平均数量。 一个已经准备好了1个 − 10个FITC分子与HI分子相连,但具有1个FITC分子的HI共轭物主要用于表观荧光显微镜实验。


朗缪尔单层制备。 Langmuir单层实验中使用的HI溶液浓度为0.30 mg/mL,通过将HI粉末溶解在盐酸水溶液(pH 2)中制备。 对于作为朗缪尔单层进行的所有实验,亚相(纯水)的pH值为5.6。 Kibron槽和KSV槽的铺展液体积分别为80和40μL。 HI溶液在空气中扩散 − 水界面,使用100μL注射器(Hamilton Co.,Reno,Nevada),在亚相表面均匀沉积小液滴,然后等待15分钟,以使Langmuir单层达到平衡。 压缩率设定为10mm·min − 1. 所有等温线和原位紫外光谱 − 在温度(20.0±0.5℃)和湿度(50±1%)保持恒定的洁净室(1000级)中进行可见光、荧光和辐照光谱测量。


表面化学和光谱学方法。 使用面积为5.9 cm×21.1 cm的Kibronμ-槽(Kibron Inc.,芬兰赫尔辛基)测量表面压力 − 面积(π) − A) 等温线 − 减压周期和稳定性研究。 表面电位 − 面积(ΔV − A) 使用由电容式系统组成的开尔文探针在Kibron槽上获得等温线。 振动板设置在朗缪尔单层表面上方约1 mm处,镀金槽底座用作对电极。


空气中的光谱测量 − 使用HP 8452 A型紫外分光光度计获得水界面 − vis和Fluorog-3荧光分光光度计(Horiba Scientific,爱迪生,新泽西州)用于荧光。 HI-Langmuir单层膜在空气中的荧光光谱 − 使用面积为0.25 cm2的分叉光纤测量水界面,并将其放置在亚相表面上方1 mm处。 激发光通过光纤从光源传输到朗缪尔单层膜,朗缪尔单层膜的发射光通过光纤传回检测器。 紫外线 − 在Perkin Elmer Lambda 900 UV/vis/NIR光谱仪(Norwalk,CT)和Fluorog-3荧光光谱仪(与用于Langmuir单层的荧光光谱仪相同)上分别使用1 cm光程长度的石英反应杯记录水溶液的可见吸收光谱和荧光光谱。


表观荧光显微镜用于观察Langmuir单层(如有)中区域的形成。 显微镜需要在样品台顶部放置朗缪尔槽。 石英窗允许激发光穿透亚相,以便在空气中激发荧光团 − 水界面。 实验装置使用Kibronμ-槽(Kibron Inc.,芬兰赫尔辛基)和荧光显微镜(Olympus IX-FLA)相结合。 可用于铺展溶液的面积为5.9 cm×21.1 cm。 该荧光图像由热电冷却光电Magnafire CCD相机拍摄。


布鲁斯特角显微镜(BAM)用于观察朗缪尔单层的形貌。 使用IElli-2000成像椭偏仪在关闭补偿器和BAM2plus软件的情况下进行测量。 IElli2000系统的标准激光器是倍频Nd:YAG激光器(50 mW输出),使用532 nm线。


使用JASCO J-810分光旋光仪获得圆二色性(CD)光谱。 在25°C下,使用2.0 mm光程长度的石英电池,在195和250 nm之间记录光谱。


水溶液的红外光谱是使用衰减总反射率获得的。 使用生物ATR辅助装置,将水样沉积在ATR晶体表面,很容易获得红外光谱。 静态模式只需要15分钟 − 20μL水溶液; 但是,水溶液的浓度应大于0.5 mg/mL,以确保与ATR晶体适当接触。 水银 − 镉 − 碲化物(MCT)探测器(Kolmar Technologies)的扫描速度为5 kHz。 背景光谱为纯水。 将生物ATR细胞II置于Bruker Optics Equinox55 FTIR的细胞室中。


红外反射 − 使用EQUINOX-55傅里叶变换红外(FTIR)光谱仪(Bruker Optics,Billerica,MA)对Langmuir单层进行吸收光谱(IRRAS)测量,该光谱仪配备适用于空气的XA-511外部反射附件 − 水界面实验。 红外光束聚焦在空中 − Kibronμ-槽的水界面。 反射的红外光束进入了由液氮冷却的HgCdTe(MCT)探测器。 获得的光谱分辨率为8 cm − 1通过对1200个p极化扫描和800个s极化扫描的叠加。



人胰岛素的朗缪尔单分子层膜的表面化学和光谱学性质——摘要、介绍

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