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蛋白质外聚物中多糖的比例——方法

来源:上海谓载 浏览 12 次 发布时间:2021-10-12

二、方法


2.1. 中宇宙的实验方法


海水是从墨西哥湾收集的,用于填充 12 罐,每个 130 L,其中 4 个处理一式三份: 对照(海水)、WAF(用 Macondo 替代油,一种轻质低硫原油,化学性质类似于 在深水期间从 Macondo 井中溢出的石油 Horizon 事件)、CEWAF(Corexit + oil 比例为 1:20)和 DCEWAF (CEWAF 稀释十倍)。 仔细描述了中间宇宙的设置 在韦德等人。 (2017) 以及准备 WAF 的程序, CEWAF 和 DCEWAF。 简而言之,注入油或油 + Corexit 进入带挡板的再循环罐并混合约 24 小时,然后将下层 分数(即,避免表面光滑)被添加到各自的 坦克。 有关中宇宙实验的信息在表 1 中给出 根据估计值添加初始和最终油浓度 根据 Wade 等人确定的油当量 (EOE)。 (2011 年,2017 年)。 实验持续 3 到 5 天,运行 12:12 明暗循环。 在表 1 中,对于使用沿海 用微生物浓缩物修正的水域,浮游生物(≥63 μm)是 用网收集并转移到聚碳酸酯瓶中。 这个 将浓缩的浮游生物块引入罐中并搅拌(2 L 到每个)在开始实验之前。 对于公海水域和沿海水域的中宇宙,营养物质进行了修正, 添加营养物(最终浓度 f/20)并搅拌罐。


表格1 中观的实验设计。



本研究的样品是从水柱中提取的 24 小时,根据 Xu 等人详细介绍的方法进行分析。 (2018a,2018b)。 简而言之,对于本研究,从水中提取的样品等分试样 通过 0.45 μm FlipMate 以 < 100 mmHg 的压力轻轻过滤色谱柱 去除颗粒的装置 (Environmental Express SC0301C)。 这 然后在 3 kDa 超速离心膜(Amicon Ultra-15,EMD # UFC900396)中处理 0.45 μm 滤液以收集胶体(3 kDa 截留物)级分。 收集 3 kDa 截留物并 用 18 MΩ -cm 冲洗 3 次,直到最终体积至少浓缩 25 倍。 这种 EPS 胶体部分来自水中 然后将 < 0.45 μm 和 > 3 kDa 的色谱柱用于本工作中提到的大多数测量。 测量每个EPS胶体样品 对于蛋白质和多糖,如下所述,并用 3 kDa 超滤渗透液(真正溶解的部分;滤液) 3 kDa 超滤器)来自用于测量的对照处理 SFT 以保持原始中宇宙样本的离子组成。


2.2. 化学品和实验室器具准备


除非另有说明,所有化学品均来自 Sigma 并且是 97% 纯 ACS 级或更高。 除非使用的水是天然海水,否则所有使用的水都是 18 MΩ –cm Milli-Q I 型水。 除非 指定,ASW(Millero 1996,第 67 页),单个组件 MgCl2、NaCl 和 Na2SO4 在 450°C 下燃烧 4 小时。 所有实验室用品 用自来水冲洗三次,在 1% 的溶液中浸泡 12 小时。 Micro-90® 肥皂溶液(VWR,目录号 89210-140),用 18 MΩ –cm Milli-Q 水,在 3 M HCl 中浸泡 12 小时,并冲洗三次 18 MΩ –cm Milli-Q 水。 如果使用玻璃器皿,则另外 在 450 °C 下燃烧 4 h。


2.3. 标准生物大分子实验


为了评估蛋白质和多糖(单独 或组合)在 SFT 上,实验是在人工 海水,ASW,使用牛血清白蛋白(BSA,来自 Pierce 蛋白 检测试剂盒,ThermoFisher),其等电点 pI 为 4.7–5.4 (视情况而定)。 此外,为了代表多糖,我们 使用过存在于水中的葡萄糖醛酸(Sigma,CAS 6556-12-3) 墨西哥湾柱(Hung 等人,2003 年;Xu 等人,2011 年)。 它是一个 具有与 D-甘露糖醛酸相似物理化学性质的差向异构体和 L-古洛糖醛酸,海藻酸的主要成分和丰富的 细菌外聚合物、生物膜和褐藻的成分。 葡萄糖醛酸的 pKa 为 2.8-3.2(取决于分子构型)。 在 pH 值为 ~8 的 ASW 中,这些部分将被去质子化,这将增强它们的表面反应性。


2.4. 表面张力


SFT 使用 Kibron EZ Pi-Plus 张力计测量,该张力计 采用 Du Nouy-Paddy 技术结合 0.5 mm 直径探针(Padday 等人,1975 年)。 探针是金属合金的 一种亲水性氧化物,与样品的接触可以忽略不计。 这 聚丙烯杯中的 1.5 mL 样品使用循环水浴保持在 22.5 ± 0.3 °C 的恒温。 探针是 通过用丁烷炬燃烧来清洁样品之间。 每个 样品至少测量四次,重复测量显示 ≤ 5% 的相对标准偏差 (RSD)。 这 仪器针对 18.2 MΩ –cm 电阻率 I 型水进行校准。 疏水部分的浓度越高 EPS 胶体分数越低,表面张力越低。 因此,由于聚丙烯杯可能会吸附样品中分子的更多疏水成分,因此实际的表面张力可能 低于表观测量值,因此我们的测量值是 保守的。


2.5. 蛋白质和多糖测定


EPS 中的蛋白质含量是基于改良的二辛可宁酸方法(Smith 等人,1985 年)使用 Pierce 蛋白质测定的 检测试剂盒(ThermoFisher),以 BSA 为标准。


使用蒽酮方法(Morris 1948)测定中性糖浓度,以葡萄糖为标准。 对于蒽酮试剂,0.05 g 蒽酮(CAS 90-44-8;终浓度 1 g/L 蒽酮)溶于 50 mL 浓硫酸中 玻璃烧杯,然后搅拌。 在每次应用此方法之前立即制备蒽酮试剂。 对于葡萄糖 标准储备液,将 50 mg 葡萄糖(CAS 50-99-7;终浓度 1 g/L 葡萄糖)溶解在 50 mL 离心管中,然后填充 用 Milli-Q 水定容至 50 mL。 标准品的储备溶液是 稀释至最终体积 10 mL,例如,对于 5 mg/L 标准品 溶液,0.05 mL 储备溶液,用 9.95 mL Milli-Q 水稀释。 然后抽取各标准溶液 0.1 mL 和样品 0.1 mL 放入单独的 Pyrex 玻璃管中。 我们向每个管中添加了 0.2 mL 蒽酮试剂溶液并在 100°C 下加热 10 分钟。 之后 孵育,试管立即在冰浴中冷却或 运行自来水,使它们迅速达到室温。 这 在光电色度计中在 620 nm 处测量光密度。 该方法用于测定中性糖; 它不会 检测带电糖,如糖醛酸。


通过添加硼酸钠 (75 mM) 来估计糖醛酸 浓硫酸和间羟基二苯,含葡萄糖醛酸 酸作为标准(Hung 和 Santschi 2001)。


蛋白质、中性糖和糖醛酸的浓度, 以 BSA、葡萄糖和葡萄糖醛酸当量表示,相对于溶解的有机碳(蛋白质 53%,40% 中性糖,糖醛酸 37%)。 然后蛋白质与多糖的比例计算为蛋白质/TCHO,其中TCHO(总 碳水化合物=中性糖+糖醛酸)。 因此,蛋白质:多糖的比例是(蛋白质 * 0.53)/[(中性糖 * 0.40)+(糖醛酸 酸 * 0.37),其中所有浓度均以 mg-OC/L 为单位(OC 是有机的 碳)。 EPS 组成和浓度计算公式为 从三个复制的中胚层罐中收集的样品 每个处理(n = 3)。


2.6. 溶解有机碳测定


DOC 的浓度是在 Shimadzu TOC-L 分析仪上使用高温燃烧法测量的(Xu 等人,2011 年;Guo 等。 1994)。 来自 0.7 um 预燃 Whatman GFF 的样品滤液 用 2N HCl 溶液将膜酸化至 < pH 2,然后吹扫 用纯空气吹 10 分钟以去除无机碳。 样本是 然后在 680 °C 下燃烧并进行 CO2 测量以确定碳量。 为了计算 DOC 浓度, 减去系统空白并根据校准计算 曲线使用羟基邻苯二甲酸钾作为标准。 样品 波动系数超过 3% 测量 3 次, 给出最低波动因子的两个值的平均值是 采纳。


2.7. 共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM)


共聚焦激光扫描显微镜图像是用 蔡司 LSM 880 共聚焦光谱显微镜成像系统,使用 Zstack 软件。 所有样品均使用人工海水制备 (ASW) 购自 Sigma(S9883 海盐)并以 40 g/L 配制。 为了制备 WAF,将 200 μL Macondo 替代油缓慢加入到 在 500 mL 硼硅玻璃制成的瓶子中过滤 ASW 海水 带有特氟龙衬里的帽子。 搅拌混合物并使其平衡24小时以制备WAF。 CEWAF 的制作方式相同,除了 在混合之前,Corexit 以 1:20 的 Corexit 与油的比例添加 与 ASW(Chiu 等人,2017 年;Wade 等人,2017 年)。 Corexit 治疗 除了将 Corexit 添加到 ASW 组成 0.1% 的溶液。 溶液终浓度 BSA 和海藻酸 (Sigma, CAS 9005-38-3) 的浓度也为 0.1%。 这 将 500 mL 处理液倒置几次,然后将 20 μL 等分试样移液到载玻片上,与 100 mM 金霉素孵育 (CTC, Sigma CAS 64-72-2) 染料溶液在每次处理约 30分钟。 如染料分布所示,分子扩散在小体积内快速。 图像是在激发/发射 495 nm/519 nm 在 1 毫秒的时间内。


2.8. 扫描电子显微镜 (SEM)


SEM 样品首先过滤到 0.03 um 聚碳酸酯上 跟踪蚀刻膜过滤器(SPI Supplies, West Chester, PA, USA),然后 使用 4% 多聚甲醛固定,然后用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤,然后用去离子水冲洗(Tsai 等人,2017 年)。 使用 30%、50%、75%、95% 和 100% 的甲醇完成脱水(Tsai 等人,2017 年)。 使用 CO2 临界点干燥器去除 任何残留溶剂。 最后,在上面溅射镀上一层薄薄的金 这些基材。 然后使用 FEI Quanta 200 获取图像 ESEM 系统(Tsai 等人,2017 年)。


蛋白质外聚物中多糖的比例——摘要、简介

蛋白质外聚物中多糖的比例——方法

蛋白质外聚物中多糖的比例——结果与讨论

蛋白质外聚物中多糖的比例——结论、致谢!


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