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微尺度区域内静电相互作用力动态调节和脂质双分子层的分布——实验材料和方法

来源:上海谓载 浏览 641 次 发布时间:2021-10-28

二、实验


2.1 材料


二油酰磷脂酰胆碱 (DOPC)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸 (DPPS)、胆固醇 (Chol)、棕榈酰鞘磷脂 (pSM) 和亲脂性荧光探针 La-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明 B 磺酰基)(铵 盐)(鸡蛋转磷脂酰化,鸡肉)购自 Avanti 极性脂质(阿拉巴斯特,阿拉巴马州)。


在 Cl3CH/CH3OH 2 : 1 v/v 中制备脂质混合物 得到 1 nmol mL 的溶液? 1 总浓度与所有 所使用的溶剂和化学品具有最高的商业价值 纯度可用。 脂质单层和双层的制备 并在 (22 ? 1) 1C 的 0.145 M NaCl 亚相上表征 使用从 Milli-Q 系统 (Millipore) 获得的水,18 MO cm。


透射电子显微镜 (TEM) 网格用于 组装独立的平面双层获得 来自 SPI Supplies(美国西切斯特)。


2.2 方法


2.2.1 脂膜观察。


经典脂筏混合物 含有饱和脂质、不饱和脂质和胆固醇 被用来进行实验。 混合物 DOPC : pSM (1 : 1) + 25% Chol 和 DOPC : DPPS (1:2) + 20% Chol 选择用于中性和带电域的实验, 分别。 呈现相分离的组合物是 选择的目的是观察和跟踪领域 单层和双层的微米尺寸。 为了那个原因 目的是将 1 mol% 的荧光探针加入到 混合物。 由于荧光探针浓度较密 相较低,液相有序相中的域 (Lo) 在显微照片中显得更暗。 富集Lo相 每种混合物中的 pSM 和 Chol 或 DPPS 和 Chol。40-44


脂质单层的制备和表征使用 Langmuir 薄膜天平(微孔、Kibron、赫尔辛基、 芬兰)置于倒置荧光的舞台上 显微镜(Axiovert 200,Carl Zeiss,Oberkochen,德国),物镜为 20、40 或 100。 图像已注册 使用 CCD 摄像机(IxonEM+ 型号 DU-897,Andor 技术)。


独立的平面脂质双层是通过形成的 使用镀金 TEM 网格的 Langmuir-Blodgett 转移 3 毫米直径,带有 200 个六边形穿孔,每个穿孔 100 毫米。 金表面用十八烷基硫醇修饰 产生疏水性底物,如前所述。 39,45 在进行沉积之前,对网格进行了预处理 1 mL 4% v/v 十六烷的己烷溶液。 一次己烷 蒸发,剩余的十六烷提供适当的 双层形成的高原-吉布斯边界(圆环)。40,46,47 In 这样,含有所需混合物的单层被 压缩到 28 mN m? 1 ,然后表面压力为 在薄膜转移过程中保持恒定。 这个表面压力是 足够高以实现有效的薄膜转移,以及 低到仍然存在相分离,因为临界 这些混合物在 22 1C 的点接近 33 mN m? 1 . 这 底物通过脂质界面垂直下降,并平行于玻璃底部放置 槽,以便使用倒置的观察双层 显微镜。 双层保持在亚相下, 稳定了几个小时。


实验装置允许原位可视化 沉积后的单层和双层如图所示 图 1A。 单层的代表性图像和 还显示了双层。 中性单层的显微照片 图 1B 显示了在薄膜转移之前。 之后立马 其转移,双层荧光出现均匀 (见图 1C),但在 10-15 分钟后,相分离 观察到(图 1D 和 E)。 这个滞后时间是一致的 自发变薄过程所需的时间 由于溶剂从双层中间迁移到 支持边界。47,48 一些双层在 当电网容纳时转移或通过水通量 观察,可以在图 1C 的右下角观察到。 此外,中性和带电双层显示在 图1D和E分别。 分析的区域对应 总是在双层的中心以避免影响 由于靠近高原-吉布斯边界(方形 在图1E)。

图 1 用于生成和观察朗缪尔单层和平面独立双层的实验装置 (A)。 代表性图像显示 表面压力为 28 mN m 的中性朗缪尔单层膜? 1 (B), 转移后立即包含多个同质双层 (C) 的网格, 和 突出显示的孔(C 中的插图)的放大图,以及显示相共存的中性 (D) 和带电双层 (E)。 橙色虚线方块 (E) 中显示的是用于分析的区域的示例。


应该注意的是,用于此的双层域 研究总是通过两个半层耦合,并且仅在 孤立的案例域出现解耦,如提议的那样 此域大小范围(参见 ESI,† S1)。49 域间斥力随着距离的减小而变化 在相似区域的域之间,这是通过 增加液体占据的总面积 ESI† (S2) 中详述的有序相 (%Lo)。


据我们所知,这是第一次,这种双层 在 TEM 网格上形成的系统用于查看和研究系统 呈现相分离。 注意优点之一 这个实验设置的一个特点是转移后,双层是 形成在网格的几乎所有孔中,允许分析 从单个实验中获得的多个双层,以及 改进数据采集和统计。


2.2.2 域跟踪和扩散测量。


在 为了获得域的扩散系数(D),对 小域(1-3 毫米半径)在视频中被跟踪 15–20 秒(150–200 帧,每帧 0.1 秒)如所述 50 软件程序 Image-J 用于执行 允许图像分割和插件"Mosaic Suite" 通过图像跟踪粒子。 51 有关更多详细信息 以及获得的图像分割和轨迹的示例 在对流阻力下,参见 ESI†(S3 和 S4)。


2.2.3 域和均值的径向分布函数 力相互作用势。


径向分布函数 g(r) 是为膜平面上的域计算的 双层和单层作为数量的函数 域,由有序液体的面积百分比量化 相状态,%Lo。 150帧的视频分为三个 部分,以及域中心之间距离的直方图 (r) 使用来自 50 个连续帧的数据构建,并且 报告的 g(r) 值是平均这些直方图的结果。


根据上述测定,平均力势为 计算依据:

其中 b 是 (kT)? 1 和 w(r) 表示平均力势 域之间。 52 w(r) 曲线的第一个谷(其中 对应于 g(r) 曲线的第一个峰)被拟合为 二次函数和从它的曲率一个有效的弹簧 计算常数,用于量化 域间交互。


2.2.4 域合并。


以量化比率为目的 域的融合,双层和单层的视频是 拍摄 15-30 分钟,中间间隔 5 秒 帧。 相对于第一张显微照片计算了一段时间内的域数量,每个照片平均 12 张 分钟。 这些视频是针对 40%Lo 的膜拍摄的 所有系统,并在 28 mN m 的固定表面压力下? 1 在 朗缪尔单层的情况。 时间零是在此刻设置的 在双层情况下的域外观,以及在点 达到了单层所需的表面压力。



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