摘要

空气-水界面（AWI）上的蛋白质组装在许多生物过程中自然发生，并提供了一种制造生物材料的方法。然而，在AWI中控制蛋白质自组装的因素以及吸附过程中发生的动力学过程仍然没有得到充分的探索。利用荧光显微镜，我们研究了在AWI处组装的一种模型蛋白，即用德克萨斯红色荧光团最低限度标记的人血清白蛋白。在低亚相浓度下获得静态和动态信息。通过改变溶液蛋白质浓度、离子强度和氧化还原状态，我们相应地改变了AWI处蛋白质组装的微观结构。pluronic表面活性剂的加入导致AWI发生相分离，通过光漂白实验后的荧光恢复显示出流体表面活性剂结构域和更坚硬的蛋白质结构域。在这一竞争吸附过程中，观察到蛋白质结构域聚结。

1.介绍

众所周知，蛋白质在空气-水界面（AWI）的行为在食品科学中对于增强泡沫稳定性和蛋白质结晶以指导有序组装具有重要意义。1,2它在许多生物技术应用中也具有相关性，例如，蛋白质溶液在平面上的行为以及在流体设备中的行为，其中蛋白质吸附在固体水和空气-水界面上都非常重要。3在医学上，肺表面活性物质和血清蛋白在肺泡水衬里层上的竞争性吸附因其在急性呼吸窘迫综合征中的作用而被广泛研究。4,5在气体栓塞中也很重要，在血液中，气泡可以将蛋白质吸收到其表面，并导致流向受影响区域的血流和氧气输送减少（即栓塞）以及凝血。6对这些过程的干预或操纵需要对蛋白质在AWI形成的组装有更深入的了解。

从另一个角度来看，AWI是一种独特的工具，用于将蛋白质作为小的构建单元引导到更大的自组装结构中。蛋白质是天然存在的生物聚合物，具有非对称分布的掩埋和溶剂暴露的活性位点、静电电荷和疏水/亲水残基。这些特征，再加上几何约束，决定了折叠蛋白质及其较大组装体的结构。组装复杂的生物或合成系统的一种策略是促进一个或两个维度的相互作用。液体界面在这方面特别有用，因为其中存在各向异性力和二维空间限制。7-9除了液体界面的特殊特性外，通常控制自组装的因素是构建块的化学和结构互补性。10对于蛋白质等大分子，其活性部位、几何结构以及静电和疏水相互作用受到周围溶剂分子和其他溶质的极大影响。11,12因此，溶液条件为在AWI处控制蛋白质组装提供了方便的手柄。

先前的张力测定法、反射测定法和椭偏测定法研究了AWI中蛋白质的表面过剩变化和结构构象与溶液条件（如亚相浓度、pH值和离子强度）的关系。13-16这些技术在宏观尺度上提供了吸附蛋白质的整体平均特性。为了在纳米到微米尺度上研究AWI的组装结构，已经应用了原子力显微镜（AFM）、布鲁斯特角显微镜（BAM）和荧光显微镜等成像技术。17-19 AFM提供纳米空间分辨率，但涉及将界面膜转移到固体表面，这导致结构保真度和时间分辨率的损失。17 BAM与Langmuir槽耦合是一种广泛使用的原位方法，但其空间分辨率（2μm）低于许多衍射受限光学成像技术，且动力学信息很少。18,20 Fujita等人对AWI的疏水螺旋肽组装21和Gluck等人对多糖吸附22的开创性研究表明，荧光显微镜有可能作为研究AWI大分子自组装的简易原位成像工具。通过这种技术，Powers等人发现了在AWI上自组装的两亲性肽的中等依赖性微米级相域。23在这项具有里程碑意义的研究中所做的观察尚未推广到蛋白质系统。在这里，我们首次证明了通过系统地改变溶液条件来控制AWI蛋白质自组装微观结构的能力。

本研究以得克萨斯红标记的人血清白蛋白（HSA-TR）为模型蛋白，在不同溶液条件下用原位荧光显微镜研究了其自组装的微观结构。人血清白蛋白（HSA）提供了一个有用的模型蛋白质系统，因为它的生物物理性质已经在溶液中和AWI中得到了很好的研究。16,24其相关性来自于一个事实，即HSA是人体血浆中最丰富的蛋白质（3.5-5.0 g/dL），用于维持血浆胀亡压和转运配体。当气体栓塞进入血管时，血浆蛋白（如HSA）在气体-血液界面吸附和聚集。25这些界面蛋白层被怀疑会影响气泡与内皮表面的粘附，并通过与内皮或血小板表面上的大分子相互作用引发血液凝结。26

HSA由一条含有585个氨基酸的多肽链组成，其中包括35个半胱氨酸和59个赖氨酸。三十四个半胱氨酸形成17个分子内二硫键，单一的反应性Cys34对氧化还原状态极为敏感。24,27 X射线结晶学证实HSA具有α-螺旋二级结构，并在生理条件下鉴定出一个心形或等边三角形三级结构，一侧80Å，厚度30Å。24反射计研究还发现界面处的血清白蛋白层厚度为30-40Å，但蛋白质被近似为一个椭球体，长轴平行于界面140Å，垂直短轴为40Å。16光谱和流变学方法先前已在AWI处发现单层HSA粘弹性膜，蛋白质保留其二级结构。16,28,29

目前的研究应用原位荧光显微镜在一个小型成像室中研究AWI处的蛋白质组装∼10μL溶液，同时限制液-固界面上的竞争性蛋白质吸附。形成了一个稳定的界面，蒸发量可以忽略不计，这使得在亚微米的空间分辨率和毫秒到小时的时间尺度上可以获得AWI处蛋白质行为的静态和动态信息。我们的结果揭示了在AWI形成的微尺度蛋白质组装，并强调了溶液条件在控制组装结构中的作用。还观察到AWI处的相分离动力学转变。

应用荧光显微镜研究了蛋白质在气-水界面的组装——摘要、介绍

应用荧光显微镜研究了蛋白质在气-水界面的组装——材料和方法

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应用荧光显微镜研究了蛋白质在气-水界面的组装——结论、致谢！