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应用荧光显微镜研究了蛋白质在气-水界面的组装——材料和方法

来源:上海谓载 浏览 135 次 发布时间:2021-12-14

2.实验材料和方法


第二节一般试剂。对于所有步骤,均使用去离子水(去离子水,Mar Cor优质混床去离子,25°C时电阻率为18.2 MΩ3 cm)。通过在去离子水中溶解适量的NaH2PO4和NaN3,然后用1 M HCl调节pH至7.2,制备用于荧光显微镜的磷酸盐缓冲盐(PBS)溶液;在整个研究过程中,最终浓度为10 mM磷酸盐和30 mM NaN3。PBS的离子强度通过添加NaCl来调节。Pluronic F-127(Invitrogen,MW∼12 500)用PBS稀释至0.010 mg/mL作为储备溶液。二硫苏糖醇(DTT)购自Fisher Scientific。


通过荧光显微镜对AWI处的蛋白质组装进行成像。如图1A所示,HSA-TR在一个特殊设计的密封室中成像,其中蛋白质水相(体积10μL,厚度100-200μm)与一层厚度也为100-200μm的空气共存。该室由聚二甲基硅氧烷组装而成,并用聚乙二醇(MW 5000)对覆盖玻璃进行改性,以减少蛋白质在固液界面上的竞争吸附。(参见支持信息中的样品室和表面改性以及图S1。)在该室中形成的AWI与显微镜台形成的XY平面平行。与之前对圆形液滴成像的尝试相比,这有助于界面成像。通过在界面处聚焦(称为XY平面图像)或以0.1μm/步的步长垂直于界面扫描(称为XZ平面图像),收集了23,30张图像。使用Olympus IX81倒置显微镜获取共焦图像。表观荧光图像由耦合到奥林巴斯IX81系统的高光谱CCD(CRi Nuance FX)相机捕获。物镜(40,浸水,1.15 NA)通过使用543 nm激光或带有530-550 nm带通激发滤光片的汞灯激发染料,从下方对样品溶液成像。在575-655nm范围内收集发射。光漂白后荧光恢复(FRAP)实验在同一共焦显微镜上进行,带有奥林巴斯SIM扫描仪装置。使用100%功率的351 nm激光在AWI处对蛋白质层的小区域进行20 s的光漂白。使用543 nm激光(停留时间为2μs/像素)在光漂白之前、期间和之后捕获区域的共焦图像。使用ImageJ软件对图像进行分析。31

图1。(A)样品室和倒置显微镜设置。(B-G)在AWI条件下,pH 7.2,离子强度=193 mM的PBS中HSA-TR的共焦图像。(B,C)HSA-TR(0.050 mg/mL)或(D,E)HSA-TR(0.025 mg/mL)的XY平面图像。图像C和E使用4倍光学变焦。穿过(F)HSA-TR(0.050 mg/mL)或(G)HSA-TR(0.025 mg/mL)AWI的XZ平面图像。比例尺:20μm。


蛋白质标记。商用HSA(Sigma-Aldrich)用胺反应性荧光团Texas Red-X琥珀酰亚胺酯(Invitrogen)标记。首先将Texas Red-X溶解在二甲基甲酰胺(10 mg/mL)中,然后缓慢添加少量该浓缩染料溶液,同时搅拌至蛋白质水溶液(0.1 M NaHCO3缓冲液中的2 mg/mL HSA,pH 8.3)。混合后染料与蛋白质的摩尔比为10:1。用铝箔覆盖反应溶液,并在室温下连续搅拌1h。然后通过10-DG柱(Bio-Rad)运行反应溶液,去除未反应的染料。用PBS洗脱标记的蛋白质,并在4°C下,在9 krpm下,用3 kDa截止分子量离心过滤装置(微孔)进一步浓缩和纯化30 min,并用10 kDa透析盒(Thermo Scientific)对1 L 10 mM磷酸盐缓冲液透析1周。以牛血清白蛋白(BSA,Thermo Scientific)为标准,通过Lowry分析(Thermo Scientific)测定标记蛋白的最终浓度。紫外-可见光谱和MALDI-TOF质谱显示标记的染料与蛋白质的比率分别为1.3和1.5。(参见支持信息中的染料与蛋白质比率测量和图S2。)将产品溶液分成等份,并在-20°C下储存以供进一步使用。


染料标记和未标记蛋白质的比较。通过圆二色谱(CD)光谱和表面压力测量对HSA和HSA-TR进行比较。将AWI处标记或未标记蛋白质形成的蛋白质层转移到云母表面,并使用敲击模式AFM(数字仪器)测量高度,并使用Nanoscope IIIa软件(5.12版,数字仪器)进行处理。


CD测量在带有珀耳帖温度控制器的Chirascan CD光谱仪上进行。在10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中,用10mM NaCl将HSA和HSA-TR稀释至0.10mg/mL,然后转移至0.1cm路径长度的试管中。HSA和HSA-TR的远紫外CD光谱在25°C下收集,波长范围为190-260 nm,扫描速率为0.5 nm/s,狭缝带宽为1.0 nm。在25℃和95℃之间记录热变性曲线,每一步增加2℃和120 s平衡时间。使用带有线探针微量天平的MicroTroughX-Langmuir槽测量表面压力(Kibron,Inc.)。将10mM PBS中的HSA或HSA-TR(0.10mg/mL)用移液管移到微槽中。在AWI立即形成后1小时内记录表面压力。然后,使用Langmuir-Schaefer技术,通过Kibron微槽控制器,将AWI处的层转移到新劈开的云母表面上。32使用去离子水进行冲洗步骤,以冲洗掉样品表面上多余的盐。样品在空气中干燥,然后在空气中使用超锐悬臂梁(NSC16,MikroMasch)在攻丝模式下通过AFM进行研究。使用WSxM软件(Nanotec)分析AFM图像以确定膜厚度。33


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