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LB膜分析仪-α-短螺旋抗菌肽对癌细胞选择性及其抗癌作用的分子机制:摘要、介绍、材料和方法

来源:上海谓载 浏览 176 次 发布时间:2022-02-28

摘要


开发对宿主细胞具有良好生物相容性但对癌细胞具有高效力的功能性生物材料和药物是一项具有挑战性的工作。通过利用天然抗菌肽和a-螺旋蛋白的优势特性,我们设计了一类新的短a-螺旋肽G(IIKK)nI-NH2(n细胞)。我们表明,含有¼n1e4的肽具有不同的效力和对癌症¼3和4的高选择性,能够有效杀死癌细胞,同时在其工作浓度下对宿主细胞保持良性,通过类似于杀菌效果的机械过程。细胞的高选择性可能源于它们优先与带有负电荷和高流动性的细胞外膜结合。除了快速透膜能力外,这些肽还可以通过线粒体途径和死亡受体途径诱导癌细胞的程序性细胞死亡,而不会诱导非特异性免疫原性反应。重要的是,这些肽还可以在小鼠异种移植模型中抑制肿瘤生长,而不会引起副作用。虽然这项研究揭示了这些肽作为强效药物和其他医疗保健应用的临床潜力,但它也指出了基础材料研究在高选择性肽功能材料未来发展中的重要性。

1.导言


寻找高效低毒副作用的新药已成为功能性生物材料研究的重要方向。尽管治疗方法取得了巨大进步,但癌症仍然是全世界致死的主要原因。化疗是目前治疗的主要策略之一,尤其是对于那些处于晚期或转移阶段的患者[1]。然而,对正常细胞和组织的严重副作用以及癌细胞容易获得多药耐药性往往与常规化疗药物密切相关。因此,开发对正常宿主细胞具有低毒性的新型抗癌药物和不利于耐药性的独特作用模式代表了开发更有效抗癌材料的新方向。这一领域的进展可能会在医疗保健和治疗策略方面开辟新的应用领域。


一段时间以来,天然抗菌肽(AMPs)及其合成类似物一直被视为新抗生素的潜在来源。AMP对广泛的微生物表现出不同的抗菌活性,有趣的是,其中一些还表现出对癌细胞的毒性,但对正常哺乳动物细胞的生物相容性程度不同[2e4]。此外,由于这些AMP主要通过非受体介导的途径作用于靶细胞膜,与传统化疗药物相比,癌细胞更难产生耐药性[3,4]。由于这些理想的特性,研究和开发具有癌细胞毒性的AMPs可能会在开发更好的抗癌药物方面取得进一步进展。短的线性阳离子AMP在与其靶相互作用时折叠成两亲构象,代表了抗菌肽的一种特别成功的结构安排[5e7]。为了提高其在治疗应用中的前景,并研究结构活性关系,已经设计和合成了许多类似物,以模拟天然AMPs的特征,并有不同的成功报道。主要障碍在于调整针对宿主细胞的毒性的效力。


为了模拟AMPs和含有简单a-螺旋重复序列的蛋白质的结构功能特征,我们最近开发了一类含有简单序列重复序列的短阳离子肽,G(IIKK)nI-NH2(n¼1e4)[8]。IIKK模块在与两亲膜接触时促进a-螺旋结构,并且随着n的增加,其结构倾向性提高。C端的额外I残基稳定了分子,进一步促进了二级结构的反应性;COO的C端电荷阻断在触发初始响应和随后的选择性调节以响应不同的外膜表面时非常敏感。因此,它们对抗天然AMP和疗法的性能需要实验验证。


我们发现这些短合成肽具有很强的抗癌活性。为了探索其实际相关性,我们利用成人皮肤真皮成纤维细胞(HDFa)进行了选择性评估,采用了我们之前使用NIH 3T3细胞系作为宿主细胞开发的培养实验方法[8]。虽然我们在这里的主要目的是研究与所设计的肽的细胞选择性和抗癌活性相关的机械过程,但本研究也检查了它们对人类淋巴细胞的免疫原性反应及其对裸鼠异种移植瘤的治疗效果。


2.材料和方法


2.1.化学试剂与细胞培养


Rink amide MBHA树脂、受保护氨基酸以及用于肽合成的其他试剂和溶剂从德国劳埃德生化有限公司(中国上海)购买。3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化铵(MTT)、钙黄绿素乙酰氧基甲酯(钙黄绿素AM)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)和异硫氰酸荧光素(FITC)-甲环素从西格玛(密苏里州圣路易斯)获得。5,50,6,60-四氯-1,10,3,30-四乙基苯并咪唑碳菁碘(JC-1)、抗Cyt c单抗体(小鼠,IgG2b)和FITC标记的山羊抗小鼠二级抗体购自Beyotime Biotechnology(江苏,中国)。所有实验中使用的水都是经过密理博密理Q去离子处理的(18.2μcm)。


HeLa(人宫颈癌细胞)和HL60(人早幼粒细胞白血病细胞)由上海细胞生物学研究所细胞库提供。成人真皮成纤维细胞(HDFa)是从体外获得的。癌细胞系在含有10%热灭活FBS(胎牛血清)的IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基)中培养,而原代HDFa细胞在补充了LSGS(低血清生长补充剂)和抗生素(阿莫西林和青霉素)的M106培养基中培养,温度为37℃,二氧化碳浓度为5%。


用标准的菲科尔法从全血细胞中分离人淋巴细胞。简而言之,用10毫升PBS稀释从健康志愿者获得的10毫升血液,然后将稀释后的血液小心地添加到1.077克/毫升的Ficoll溶液中,Ficoll与血液的比例为2:1。在2000 rpm下离心15分钟后,在不接触Ficoll溶液的情况下收集含有淋巴细胞的环。淋巴细胞用PBS洗涤至少三次,然后悬浮在PBS中使用。


通过1000 g离心从血液中分离人类红细胞(h-RBC),用PBS洗涤三次,然后在PBS中悬浮至8%(v/v)以供使用。


2.2.肽合成


G(IIKK)nI-NH2(n¼1e4)肽是使用商用CEM Liberty肽合成器,使用标准的Fmoc固相肽合成程序制备的。在Rink酰胺MBHA树脂上从C端到N端进行合成,从而产生C端酰胺化肽。更多细节,包括树脂的脱保护、偶联和切割,已在前面描述[9e11]。请注意,N端FITC标记的G(IIKK)3I-NH2也是通过固相化学合成的,我们之前的工作[8]中报告了详细的步骤。在旋转蒸发后,通过冷乙醚沉淀至少八次纯化粗肽产品,然后冷冻干燥2天。HPLC和MS分析表明,最终产物纯度高(>95%)。


2.3.细胞毒性试验


MTT法检测这些肽的体外细胞毒性。简单地说,癌症或HDFa细胞(w1105细胞/mL,100 mL)在96孔板中预培养。培养24小时后,用100毫升2倍稀释肽溶液(0e50 mM)处理细胞并继续培养24小时。然后向每个孔中加入20毫升MTT溶液(PBS中,5 mg/mL)并培养4小时。随后,直接去除HeLa或HDFa细胞的上清液,而对于HL60细胞,以1000 rpm的转速离心培养物5分钟,然后去除上清液。向每个孔中加入150 mL二甲基亚砜(DMSO),将孔的上清液转移到新的96孔板中,并使用微孔板读取器(M2 e,分子装置)记录570 nm处的吸光度。不含肽的孔用于对照,不含细胞的孔用于分光光度计的空白。实验至少独立进行了三次。


通过检测不同肽存在时h-RBC的血红蛋白释放来测定肽的溶血活性。将来自健康志愿者的h-RBC洗涤三次,并以8%(v/v)悬浮在PBS中。将100毫升2折叠肽溶液添加到96孔无菌板中的孔中。然后将等分(100 mL)的h-RBC悬浮液添加到孔中,以获得200 mL的总体积。在37℃下将培养皿培养1 h,然后在1000 g下离心5 min。将等分(100 mL)的上清液转移到新的96孔培养皿中,通过测量540nm处的吸光度来监测血红蛋白的释放。以PBS和0.1%Triton X-100中的血红蛋白释放值作为阴性和阳性对照。


2.4.G(IIKK)3I-NH2的细胞选择性


为了在体外评估G(IIKK)3I-NH2的选择性相互作用,将FITC-G(IIKK)3I-NH2加入含有原代细胞(HDFa)和肿瘤细胞(HL60)的共培养系统(8孔板),最终肽浓度为20 mM。在37C和5%CO2孵育1小时并采用适当的分离程序(详细程序见参考文献8)后,用徕卡DMI3000荧光显微镜观察两种细胞中的肽分布。


2.5.肽对不同脂质单分子膜的渗透


在多孔板Kibron微槽X(Kibron Inc.,芬兰赫尔辛基)中跟踪肽渗透到不同的脂质单层。表面压力(p)通过使用连接到Delta-Pi微天平(芬兰赫尔辛基Kibron公司)的Wilhelmy板进行监测。氯仿中的脂质溶液在空气缓冲界面(10 mM TriseHCl,154 mM NaCl,pH 7.4)扩散。在不同初始表面压力(pi,范围为10至40 mN/m)下进行溶剂蒸发和单层平衡后,将肽溶液注入单层下方,亚相中的最终肽浓度为3 mM。然后监测表面压力随时间的变化,并在30分钟内获得平衡表面压力(pt)。为了比较G(IIKK)3I-NH2穿透饱和(DPPC)和不饱和(POPC)磷脂单分子膜的能力,初始表面压力保持在30 mN/m左右。所有测量均在201C下进行。


2.6.G(IIKK)3I-NH2在HeLa细胞中的定位


将HeLa细胞(w1105细胞/mL)预先接种在6孔板中24小时,然后将FITC-G(IIKK)3I-NH2以10 mM的最终浓度添加到孔中。在37℃下培养1小时或24小时后,用PBS清洗细胞至少三次。用激光共聚焦显微镜(Nikon AI si)观察FITC-G(IIKK)3I-NH2在HeLa细胞中的分布。


2.7.膜完整性


HeLa细胞(w1105个细胞/mL)在37C下预先接种在无菌96孔板上24小时。细胞用PBS清洗,并在37C下用钙黄绿素AM(1 mM)染色30分钟。用PBS清洗三次后,向每个孔中加入100 mL PBS,并通过微孔板自动读数器记录荧光(在490 nm处激发,在515 nm处发射),所得值作为对照。随后,在37C下用最终肽浓度为10 mM的G(IIKK)3I-NH2处理这些细胞不同时间(10 min 6 h)。在肽处理后,用PBS清洗细胞三次,并再次记录细胞在100 mL PBS存在下的荧光。用PBS和1%Triton X-100处理的细胞分别作为阴性和阳性对照。


为了检查细胞形态变化,将HeLa细胞(w1105个细胞/mL)在无菌6孔板底部的盖玻片上预接种37C 24小时。预接种的细胞在37C下用浓度为10 mM的G(IIKK)3I-NH2处理24小时,然后用PBS洗涤细胞两次,用4%多聚甲醛固定15分钟。用PBS广泛洗涤固定的细胞,并用不同浓度的乙醇脱水。在临界点干燥和用溅射镀金机镀金后,使用JSM-840扫描电子显微镜在15 kV下观察样品。


2.8.F-肌动蛋白、细胞核、线粒体膜电位和细胞色素c的荧光染色


对于荧光染色,将HeLa细胞(w1105个细胞/mL)预先接种在6孔板中24小时,然后向孔中添加最终浓度为10 mM的G(IIKK)3I-NH2。在37℃下培养24小时后,用PBS清洗细胞,并用4%多聚甲醛固定15分钟。用PBS清洗固定的细胞,并在37℃下用FITC phalloidin(5 mg/mL)对其进行F-肌动蛋白染色或用DAPI(6 mg/mL)对其进行核染色30分钟。用PBS清洗后去除未结合的染料,荧光显微镜下观察染色细胞。


为了跟踪线粒体电位的变化,肽处理的HeLa细胞(本例中不使用4%多聚甲醛固定)在37C下用JC-1(10 mg/mL)染色20分钟。然后用PBS洗涤染色的细胞,并用荧光显微镜观察。


用抗细胞色素c单抗(mAb,小鼠IgG2b)对细胞色素c(Cyt-c)进行免疫荧光染色,观察细胞色素c(Cyt-c)在HeLa细胞中的分布。简单地说,在用4%多聚甲醛固定后,用0.1%Triton X-100使肽处理的HeLa细胞通透性5分钟,然后用封闭缓冲液(PBS中10%(v/v)胎牛血清)封闭30分钟。在用PBS洗涤后,这些细胞在37℃下与抗Cyt c单克隆抗体(1:50)孵育1小时,并用PBS洗涤5分钟以去除未结合的抗体,然后与FITC标记的山羊抗小鼠二级抗体(1:100)孵育1小时。在用PBS广泛洗涤以去除未结合的二级抗体后,用激光共聚焦显微镜观察这些细胞。在上述所有荧光染色实验中,未经肽处理的细胞被用作对照。


2.9.DNA片段的凝胶电泳


将HeLa细胞(w1106个细胞/mL)预先接种在无菌6孔培养皿中24小时。在37C下与10 mM G(IIKK)3I-NH2培养不同时间间隔(48、24、12和6小时)后,收集HeLa细胞,并在37℃下用裂解缓冲液(0.8%十二烷基硫酸钠、100 mM三氯化钠、20 mM EDTA、0.15 mg/mL核糖核酸酶a、pH8.0)裂解2小时。裂解后,裂解物在50℃下与20 mL蛋白酶K(20 mg/mL)再孵育24小时,然后在含有0.5 mg/mL溴化乙锭(EB)的2%琼脂糖凝胶上进行电泳。


2.10.RT-PCR(逆转录聚合酶链反应和实时聚合酶链反应)


为了确定HeLa细胞凋亡和淋巴细胞免疫效应的相关基因转录活性,进行了RT-PCR检测。简单地说,HeLa细胞与10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育不同的时间间隔(1、3、6和12 h),淋巴细胞与10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育1 h。按照制造商的说明(英国因维特罗根)用Trizol提取细胞总RNA。总RNA(1mg)通过随机引物(PrimeScript逆转录酶,日本Takara)进行cDNA合成。根据制造商的协议,使用power SYBR green PCR Master Mix kit(美国应用生物系统公司)和7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司)进行实时PCR,并通过2 DDCt方法的相对定量分析数据。相关基因的转录水平被标准化为管家基因b-肌动蛋白的值。使用以下引物:b-肌动蛋白义:50-ATGCAGGGTACATGTGGT-30,反义:50-TCGTGCGTGACATTAAGAG-30;aspase-8义:50-ATGGACTTCAGCA-GAAATCTT-30,反义:50-CATGTCATCCAGTTGC-30;fas-sense:50-attatccaaagtgtta-30,反义:50-tcacaatcatctt-CTG-30;fas-L义:50-ATGCAGCCTTCAATT AC-30,反义:50-CAATCTACAGCAAGGCAC-30;IL2义:50-CaCaAttaacctCactCC TGCCAC-30,反义:50-cGTTGATTCTGATTAGCTGTAGTCATCTG-30;IL8顺义:50-CGGAAGAACCATCCATCGTGTGG-30,反义:50-AGAATCAGAGAAG GCTGCCAAG-30。


2.11.对人宫颈癌异种移植瘤生长的抑制作用


肽,包括G(IIKK)3I-NH2和G(IIKK)4I-NH2,分别表示为3#和4#,在无菌PBS中溶解,浓度分别为0.15 mg/mL和0.5 mg/mL。当肿瘤达到平均体积100 mm3时,将PBS中的100 mL人宫颈癌HeLa细胞(2106个细胞/mL)皮下接种到5至6周龄裸鼠(BALB/c-null)的腋窝中(接种后5天),将小鼠随机分为五组(每组5只)。通过腹腔注射将200e250 mL制备好的肽溶液注射到小鼠体内,最终剂量为1.5 mg/kg或5 mg/kg,并将200e250 mL PBS注射作为阴性对照。请注意,我们将这一天定义为第0天。注射每隔一天进行九次。在治疗期间,每两天测量一次小鼠的肿瘤大小和体重。在第18天,处死小鼠,移除肿瘤,拍照并称重。