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LB膜分析仪-PPI多聚磷酸肌醇磷脂的应用(上)

来源: 上海谓载 浏览 77 次 发布时间:2022-06-27

摘要


膜脂是细胞功能的积极贡献者,是控制细胞功能(包括炎症、凋亡、迁移和增殖)的信号通路中的关键介质。最近关于多分子脂质结构的研究表明,脂质组织在调节脂质和蛋白质功能方面起着关键作用。在这方面,人们特别感兴趣的是多磷酸肌醇(PPI),尤其是磷脂酰肌醇(4,5)二磷酸(PIP2)。PIP2的细胞功能众多,但PIP2在质膜内小叶中的组织,以及控制PIP2靶向特定蛋白质的因素,仍知之甚少。为了在一个简化的平面系统中分析PIP2的组织,我们使用Langmuir单分子膜来研究亚相条件对纯化的天然衍生PIP2和其他阴离子或两性磷脂单分子膜的影响。我们报告了在生物相关表面密度下,亚相单价盐对PIP2的显着分子面积扩展效应。这种效应对PIP2具有特异性,且与亚相pH无关。破坏水结构和水介导分子间氢键的能力的潮向性试剂(例如盐、海藻糖、尿素、温度)也特异性地扩展了PIP2单分子膜。这些结果表明,在确定PIP2的组织时,水介导的氢键和头基排斥作用相结合,可能有助于解释PIP2与其他阴离子磷脂相比的独特功能。


介绍


磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PI(4,5)P2或PIP2)是膜结合脂质中唯一重要的细胞功能调节因子。尽管PIP2结构简单,在细胞中相对缺乏(<所有膜脂1,2的1%),但PIP2是多种细胞过程的关键介质。PIP2最广为认可的功能是作为底物,通过磷脂酶C(PLC)水解裂解为二酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3),这分别是蛋白激酶C和钙信号的效应器(参考文献3中进行了综述),并通过PI 3-激酶4磷酸化生成信号脂质PIP3。PIP2本身参与多种信号通路,并参与调节负责肌动蛋白细胞骨架的维持和动力学的蛋白质,5,6这些细胞骨架结构与质膜的附着,7膜运输和附着的调节,9离子通道活性,10和突触囊泡融合。11


多小啊(∼1kD)膜结合分子(如PIP2)对大量结构多样的结合伙伴具有如此多的特异性作用,目前尚不清楚。一些证据表明,PIP2信号的控制不仅来自于酶对其丰度的调节,还来自于对其空间组织的调节。支持这一假设的第一个证据是发现细胞膜中PIP2的重要部分不可用于PLC水解,12,13以及体外PLC活性对单层中PIP2浓度的依赖性。12种耐去污剂膜组分被证明富含PIP2,14,15可能表明PIP2定位于膜筏。使用GFP标记的PIP2结合域9,16和荧光抗PIP2抗体15,17的成像方法同样证实了空间上不同的PIP2组分的可能性。尽管这些结构域的存在及其功能意义存在争议,18,19 PIP2的空间分离仍然是调节这一关键脂质信使的一种可能机制。


尽管有越来越多的证据表明PIP2存在空间上不同的池,但此类域的形成机制尚未确定。一些研究表明,蛋白质的非结构化多元酸结构域(特别是MARKs)与多个PIP2分子之间存在相互作用,允许通过非特异性静电吸引2、15、20–23浓缩这种脂质,并屏蔽脂质与其他潜在的细胞靶点。该假说认为相邻PIP2分子之间的相互作用主要由电荷密集的聚阴离子头基之间的静电排斥作用决定。另一方面,最近对含有PIP2的脂质体进行的实验表明,由于氢键的吸引力相互作用,PIP2结构域的存在与蛋白质无关。24,25


在这里,我们展示了纯天然衍生PIP2单分子膜的实验结果,这些单分子膜强烈支持相邻PIP2分子之间存在吸引相互作用,从而反对阴离子头基的静电排斥。比较PIP2与其他酸性磷脂在一系列亚相条件下的面积压力等温线,揭示了静电效应对膜表面压力的影响程度。几种不带电的潮向性的影响排除了严格的静电解释,并突出了氢键或脂头基团水合作用在维持平面系统中PIP2物理状态中的重要性。最后,观察到的效应对其他阴离子和肌醇基脂质的特异性表明,PI(4,5)P2可能具有形成氢键网络的独特能力,作为其结构和功能隔离的机制。


方法


脂质和试剂。天然脂质(牛肝L-R-磷脂酰肌醇、猪脑L-R-磷脂酰肌醇-4-磷酸、猪脑L-R-磷脂酰丝氨酸和猪脑L-Rphosphatidylinositol-4,5-二磷酸)以1 mg/mL溶液(PPI用氯仿/甲醇/水20:9:1;PS用氯仿)的形式从Avanti(Alabaster,AL)购买,并储存在-20°C下。合成PIP2类似物(Avanti,二油基磷脂酰肌醇(x,y)二磷酸)以干燥的0.1 mg等份购买,溶解在所提供的溶剂中,并储存在-20°C下。在有机成分酸消化后,首先通过磷酸盐分析确认脂质溶液的浓度26,随后通过与每个脂质分子的测量面积进行比较来确认。亚相试剂HEPES、EDTA、D-海藻糖和尿素从Sigma(密苏里州圣路易斯)购买,CsCl、NaCl、KCl、LiCl、MgCl2和CaCl2从Fisher(NH州汉普顿)购买。


压力面积等温线。用10 mM HEPES,0.1 mM EDTA,pH 7.4溶解于18.2 M中制备单层亚相ΩddH2O。对于低pH实验,缓冲液为10 mM磷酸钠;通过0.2µm注射器过滤器(Sigma)过滤25-30 mL亚相溶液,并将其添加到MicroTroughX Langmuir槽中(芬兰赫尔辛基Kibron股份有限公司)。通过隔膜从-20°C下储存的容器中提取约7 nmol的脂质,以防止溶剂蒸发,并缓慢沉积在亚相表面。在单层稳定10分钟后,通过使用微步电机移动槽的屏障,以15Å2/分子/分钟的速度压缩脂质。使用Wilhelmy method26和FilmWare软件包(Kibron)使用表面探针监测单层表面压力。脂质含量低和沉积速度慢是单层等温线重现性的关键参数。纯PIP2的单层不能被压缩过去∼在我们的实验中,37 mN/m,因为微槽的特氟隆涂层屏障在高表面PIP2浓度下润湿;因此,无法测量PIP2单分子膜的坍塌压力,但其下限至少为37 mN/m。使用循环水浴维持子相的温度。


时程实验。将约0.01 nmol的PIP2沉积在1 mL过滤子相的界面上,并将其添加到多孔板(Kibron)的单孔中。添加脂质,直到表面压力增加到15-20 mN/m之间。脂质保持稳定∼30分钟,直到表面压力稳定(在1 mN/m范围内)几分钟。通过进样口将50µL 5 M NaCl添加到亚相中,并测量表面压力随时间的变化。