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采用壳聚糖-三聚磷酸酯-百里香纳米颗粒经热喷墨打印而成的新型活性包装材料——材料和方法

来源:Unisense 浏览 15 次 发布时间:2021-09-13


材料和方法


2.1.材料


2.1.1.藜麦粉


(Chenopodium quinoa Willd.)由“Cooperativa Las Nieves”(智利VI地区)提供。面粉在4℃下储存直至使用。


2.1.2.壳聚糖


壳聚糖薄膜(Qo)。壳聚糖膜(Qo)脱乙酰度为88.5%的脱乙酰度为88.5%的壳聚糖膜(Qo)来自蟹壳的NMR-H1和600 kDa的Mwn,购自SigmaeAldrich,USA(C48165)。


壳聚糖纳米颗粒低分子量壳聚糖Qo(QoLMW)购自SigmaeAldrich,Inc.(St.Louis,MO,USA,C448869),具有以下特性:比浓粘度(hsp/c)¼203(mL/g),粘度平均值摩尔质量(Mv)=269 kDa,通过NMR-H1测量的脱乙酰度为78.3%(Lavertu等,2003)。特性粘度在0.1 M乙酸(HOAc)+0.2 M NaCl中以25℃测定。粘均分子量通过使用该溶剂中的MarkeHowink常数确定,K 1/4 1.81E?03 mL/g,a 1/4 0.93(Rinaudo,Milas,&Le Dung,1993;Tapia,Montezuma,&Yazdani-Pedram,2008).


2.1.3.细菌菌株


金黄色葡萄球菌ATCC 25923(金黄色葡萄球菌);大肠杆菌ATCC 25922(大肠杆菌);铜绿假单胞菌ATCC 27853(铜绿假单胞菌);S.enterica serovar Typhimurium ATCC 14028(S.typhimurium);产气肠杆菌ATCC 13048(产气肠杆菌);和Listeria innocua ATCC 33090(L.innocua)从Instituto de Salud Pública,Santiago,Chile获得,用于抗菌活性测试。


2.2.印膜准备


2.2.1.EPQ的准备


EPQ根据Abugoch等人的方法制备。(2011)和Valenzuela等人。(2013)。藜麦粉悬浮在蒸馏水(18 g/100 mL)中,并用1 M NaOH将pH值调节至11。悬浮液在室温下搅拌60分钟,然后在21,000?g 15℃30分钟。根据布拉德福德方法(Bradford,1976)测量可溶性蛋白质含量并表示为蛋白质毫克数/毫升。EPQ是在每次需要时在使用前准备的。


2.2.2.Qo解决方案的制备


制备由1.5和2 g/100 mL Qo的柠檬酸(0.1 M)组成的溶液。将溶液超声30分钟(Fisher Scientific FS30H,德国)并在4℃下储存过夜以消除气泡。溶液在4℃下储存直至使用。


2.2.3.胶片准备


Qo薄膜由高分子量和高粘度Qo(1.5%和2.0%w/v柠檬酸在0.1 mol/L中)制成。将这些溶液(48.5±0.1 g)浇铸在低密度聚乙烯(直径1/4 8.5 cm)板上。在50℃下将薄膜干燥至恒重。从1.5%w/v的Qo溶液中获得的薄膜的表面固体密度为0.013 g固体cm-2次方。


Qo和EPQ的共混物是通过将在pH 11(6.7%w/v)和Qo(1.5%和2.0%w/v柠檬酸的0.1 mol/L)下获得的EPQ溶液以不同的Qo/EPQ比率(90:10、80:20、70:30、60:40和50:50%v/v)。将混合物的pH值调整为3.0(Valenzuela等人,2013年)。成型和干燥如对Qo所述进行。小心地从板上取下干燥的薄膜,并在测试前在22℃和60%的相对湿度下调节3天。从Qo/EPQ比为90:10的Qo(1.5%w/v)和EPQ混合获得的薄膜的表面固体密度为0.011 g固体cm?


2.2.3.NP制备


NQ是按照Calvo、Remu~n?an-L?opez、Vila-Jato和Alonso(1997)描述的程序制备的。在0.1 M柠檬酸中制备0.3%(w/v)QoLMW溶液并搅拌24小时。TPP制备的终浓度为1.0 mg/mL。将Qo溶液(输液泵KDS200,KD Scientific©)以2:1(v/v)TPP:Qo的比例逐滴加入TPP溶液(1.8 mL/min)并在室温下剧烈磁力搅拌(Calvo等等,1997)。所得悬浮液在21,000?g以14度离心30分钟(HermLe model Z32K,Wehingen,Germany)。


根据上述相同程序制备负载Th的Qo NPs(NQoThs)。制备Th(Sigma,USA,CT0501)溶液(0.1 M柠檬酸中的0.1%(w/v))并将其添加到QoLMW溶液中。将Qo/Th溶液滴加到TPP溶液中。


2.4.NQoThs的油墨配方


使用两种不同的油墨配方将纳米颗粒印刷到可食用薄膜上。根据Buanz等人的方法,通过将4.4±0.1 mg/mL NQoThs以20%或30%(v/v)分散在甘油中制备含有NQoTh薄膜的墨水。(2011)。将油墨分散体超声处理(Fisher Scientific FS30H)30分钟并在环境温度下储存直至使用。


2.5.NP的表征


2.5.1.Zeta电位、PDI和粒子流体动力学直径


Zeta电位、PDI和粒子流体动力学直径使用Zetasizer Nano ZS-20(Malvern仪器)在4.0mW和633 nm下操作,固定散射角为173度,在25度下测量。在毛细管样品管内包含的NQos和NQoThs的10 mL溶液(20%和30%甘油,w/v)中评估样品。


2.5.2.粘度测量


使用Ostwald U型管粘度计(B号,Technico,英国)在温控水浴(25冷凝)(Grant Instruments Ltd.,Cambridge,UK)中测量粘度。蒸馏水用作参考。


2.5.3.表面张力测量


用Kibron微张力计(Kibron Inc.,Finland)使用50 mL样品溶液测量表面张力。该仪器用蒸馏水作为参考进行校准(表面张力¼72.8 mN m1次方,25负降温)(Buanz等,2011)。


2.5.4.透射电子显微镜(TEM)


飞利浦Tecnai 12 Bio Twin透射电子显微镜用于观察纳米颗粒的形态。将一滴纳米颗粒分散体涂在涂覆的铜网上,然后在室温下干燥,然后进行TEM分析。


2.5.5.接触角


基于滴落法(Kwok&Neumann,1999)评估Qo和Qo/EPQ薄膜上NQoTh分散体的接触角测量值(n=10)。用微量移液管(Gilson Pipetman U2)形成NQoTh分散体的小液滴(2.0 mL)。在将液滴放置在薄膜上30秒后,使用光学系统获取液滴的图像。光学系统由连接到CCD相机(Pulnix,Inc.,San Jose,CA,USA)的变焦视频镜头(Edmund Optics,NJ,USA)组成,使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院,美国)与插件Drop Shape Analysis(Drop-analysis,2011)。


2.6.使用NQoThs制作电影


所有实验均使用未经修改的Deskjet 4000k210热喷墨打印机(HewlettePackard Inc.)进行。黑色墨盒(型号HP 675,cn690A)通过切掉顶部,去除泡沫垫,用蒸馏水冲洗掉墨水,然后用无水乙醇冲洗掉。墨盒装有20 mL的NQoTh分散体,以印刷在Qo和Qo/EPQ薄膜上。打印模板为Word 2007(微软公司)编制的8.8*8.8平方厘米的面积。打印设置适用于提供的最高分辨率的黑色墨盒(600 dpi提供180 pL/drop,HewlettePackard Inc.,2012,Pagewide技术)。每次使用后,用蒸馏水和无水乙醇冲洗小柱(Buanz等,2011)。NQoThs由TIJ印刷在胶片上。该方法包括三个步骤。第一个是通过添加20%和30%(w/v)的甘油制备NQoThs的水分散体,这会减少溶质的结晶,防止打开锁定的打印头(Buanz等人,2011年),以及修改液体的表面张力和粘度(Khan等人,2010年;Kipphan,2001年)以确保NQoTh分散体作为微滴的适当递送。第二步和第三步包括将分散体放置在改进的打印头中,并将分散体打印在Qo和Qo/EPQ薄膜上。


对于Qo薄膜,印刷面积为77.44平方厘米,厚度为0.02厘米,印刷体积为1.56立方厘米。为此,使用了HewlettePackard 4000k210型打印机。打印参数是颜色选择(黑色墨水)和最大分辨率(600 dpi),这允许传送体积为180 pL的墨滴(HewlettePackard Inc.,Pagewide技术)。含20%和30%甘油的NQoThs的储备分散体中Th的初始浓度分别为120.15和105.13 ppm。


2.7.印刷Th的测量


印刷的可食用薄膜(16平方厘米)在3 mL 1 M HCl中研磨直至完全崩解,过滤(0.45 mm Durapore PVDF Millipore),在21,000?g 20℃30 min,正己烷萃取。根据Garsuch和Breitkreutz(2010)以及Pan、Chen、Davidson和Zhong(2014)的方法,通过紫外分光光度法在273 nm处测量上清液中的Th。


Th的理论和实验浓度使用以下公式计算:


理论计算

where

ThL ¼ Th Loaded in mg/cm3,

cd ¼ Th concentration in the dispersion of NQoThs, in mg,

dv ¼ drop volume in printing (resolution in dpi), in L/平方厘米,

PL ¼ number of printed layers on the film, and

t ¼ Film thickness, in cm.




实验计算


where

ThL ¼ Th Loaded, in mg/cm3,

cf ¼ Th concentration in the film, in mg,

Pa ¼ Printed area, in 平方厘米, and

t ¼ Film thickness, in cm.




掺入效率(%)


where:

IE ¼ Th incorporation efficiency (%),

EL ¼ Experimental Load, and

TL ¼ Theoretical Load.




2.8.薄膜结构特性


2.8.1.X射线衍射


X射线衍射是使用Siemens D-5000粉末X射线衍射仪和CuKa辐射(l 1.54埃;0.02度)进行的。选择1.7-80度的θ范围来分析晶体结构。对Qo和Qo/EPQ印刷薄膜进行X射线分析。


2.8.2.薄膜微结构


通过在Hitachi TM台式显微镜(软件TM3000)上的扫描电子显微镜(SEM)对所选薄膜的微观结构进行表征。在检查之前,使用双面胶带将薄膜安装在直径为10毫米的圆柱形模具中,然后在氩气气氛(PELCO 91000)中以20 kV的电压溅射镀金3分钟,以使其具有导电性。


2.8.3.薄膜的机械性能


拉伸机械性能在配备500 N称重传感器的万能拉伸试验机(LLOYD型号LR5K,英国)上测定。


拉伸强度(TS)和断裂伸长率(%E)使用智利官方标准方法(NCh1151,1999)测定,该方法等效于ISO R1184-1970标准方法。薄膜样品被切成10毫米?50毫米的条带,并使用双夹钳以30毫米的间隔以20毫米/分钟的测试速度进行测试。记录曲线载荷与伸长的关系,直到达到断裂伸长率。TS以MPa表示,并通过将最大载荷(N)除以横截面积(m2)计算得出。最大断裂伸长率或%E是通过将断裂时的伸长率除以样品的初始标距并乘以100来确定的。报告的TS和%E值是对每种类型的样品进行的至少四次测量的平均值电影。


2.8.4.厚度


薄膜厚度(mm)是在薄膜样品上确定的,并通过数字千分尺(Mitutoyo 293340)进行测量;每部电影平均得分为九分。


2.9.水蒸气渗透率(WVP)


WVP测量是根据智利官方标准方法(NCh2098,2000)进行的,该方法等效于ASTM D1653-93和DIN 52615标准方法,使用湿杯法并测试每个样品的六个薄膜。杯中装满蒸馏水至距顶部边缘6毫米的高度。用硅胶将薄膜密封在杯子上。将杯子置于冷藏相机中,温度为0±0.6℃,相对湿度为85±2%。称量杯子的重量直至恒重。WVP是从方程估计的。(4)根据McHugh、Avena-Bustillos和Krochta(1993)。

其中WVP=水蒸气渗透率,单位g mm m-2次方h-1次方Pa-1次方;ε=厚度mm;m=质量随时间的变化,单位为g;t=h中的时间;A=薄膜面积,m2;和DP=杯内薄膜表面的校正水蒸汽分压e柜内薄膜外表面的水蒸汽分压。


2.10.从印刷的可食用薄膜中释放纳米封装的Th


使用Franz连续垂直扩散池(Gilson Inc.Middleton,WI 53562)测定Qo和Qo/EPQ薄膜中NQoThs的释放。细胞的有效扩散面积为4.7平方厘米。将薄膜安装在受体和供体隔室之间(印刷面朝下)。接受室充满1.5mL蒸馏水并保持在20℃。每天从受体中取出1.5 mL样品。将流量调整为3 mL/天,持续8天。使用紫外分光光度计(见2.5)在273 nm处测定样品的Th。结果表示为每厘米3薄膜释放的Th毫克数。


2.11.抗菌活性


2.11.1.接种物的制备


金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气大肠杆菌和无害李斯特菌分别在10 mL胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中在摇床中以37毫升培养24小时。细菌的光密度(OD)在标准McFarland标度上调整为0.5。获得的细胞最终浓度约为10-5次方—10-6次方CFU/mL。


2.11.2.NQo和NQoTh分散体的最小抑菌浓度(MIC)


评估了纳米颗粒对腐败细菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、产气大肠杆菌和无害乳杆菌生长的AM。


从储备分散体(4.4±0.1 mg/mL)制备NQoTh分散体的系列稀释液,直到浓度降低到10%。MIC被记录为在37℃(无浊度)Yoksan和Chirachanchai(2010)下孵育24小时后导致微生物无可见生长的最低浓度。


2.11.3.圆盘扩散法的抗菌活性


根据Bauer、Kirby、Sherris和Turck(1966)和NCCLS(国家临床实验室标准委员会,1990)。


将在20%甘油中印有NQoThs的两层薄膜切成6 mm2的圆盘(以获得3.0 mg/mm3 Th)并放置在接种有以下物质的悬浮液(0.1 mL of 106 CFU/mL)的Müller-Hinton琼脂平板表面上每个微生物。为了比较参数,使用未印刷的薄膜(对照)和在没有Th的情况下制备的在20%甘油中含有NQos的印刷薄膜。37℃培养24h,通过测量无微生物生长区域的直径来估计抑菌圈。


2.12.统计分析


每个实验至少进行3次,每次分析一式三份进行。通过方差分析对实验数据进行分析,并使用Tukey的多极差检验(Statgraphic 4.0版)测量平均值之间的显着差异。使用<0.05的p值来确定显着性。



采用壳聚糖-三聚磷酸酯-百里香纳米颗粒经热喷墨打印而成的新型活性包装材料——摘要、简介

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