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应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——材料与方法

来源:上海谓载 浏览 405 次 发布时间:2021-10-20


二、材料与方法


2.1. 材料


主要构成重建膜外叶的脂质购自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) 并按原样使用。 化合物 1- 棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (PC (16:0/22:6), Mw = 806.1, 纯度 > 99%) 和 1-(1Z-十八碳烯基)-2- 二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 PC (P-18:0/22:6, Mw = 818.2,纯度 > 99%) 作为氯仿溶液 (10 mg mL-1) 获得。 PC (16:0/22:6) 和 将 P-PC (18:0/22:6) 稀释以获得 1.25 mg mL-1 溶液。 来自绵羊毛的胆固醇(Chol,Mw = 711.0,纯度 > 98%)和 来自鸡蛋的鞘磷脂(SM,Mw = 386.7,纯度 > 98%) 以粉末形式获得。 两者都溶于氯仿 (HPLC 级,Carlo Erba,Val de Reuil,法国)浓度为 1.25 毫克毫升-1。


冷冻保护培养基由 Trizma 碱组成 (173.0 mM),柠檬酸一水合物 (70.0 mM),果糖 (56.0 mM)、甘油 (6.4%; v/v),最后是抗生素(青霉素 G 钠 391 mg L−1,硫酸链霉素 856 mg L−1,林可霉素 盐酸盐 204 mg L−1,硫酸壮观霉素四水合物 585 mg L-1)(Sigma-Aldrich,St. Quentin Fallavier,法国)。 这 pH 值调整为 6.2,其渗透压约为 1300.0 摩尔渗透压。


2.2. 低密度脂蛋白的提取


从蛋黄中提取低密度脂蛋白 (LDL) 根据穆萨等人的协议。 [31]。 提取后,LDLs 的浓缩提取物(22 ± 0.5 g 相当于 8.36 g 干 LDL)在冷冻保护培养基中稀释 (100 毫升)。 低密度脂蛋白样品中蛋白质的定量 微 BCA 蛋白质测定试剂盒(Pierce,Thermoscientific,法国)提供 8.9 ± 1.0 毫克毫升-1。 低密度脂蛋白样品中 PC 磷脂的含量 由鸡蛋中 PC 的自然比例计算得出(18.4 g PC/100 g ofdry LDLs) 由 Antonet al. [33] 给出。它等于 15.4 g L−1 LDLs 样本。 低密度脂蛋白还包含一小部分 PE (PC/PE 6:1) [33]。


2.3. 收集血浆精液


牛精子是从一头 Prim Holstein 公牛身上收集的,并且 立即以 10,000 × g 离心两次以回收精液 上清液中的血浆。 我们样品的蛋白质含量 是 88.5 ± 5.0 mg mL-1,由微 BCA 蛋白确定 检测试剂盒(Pierce,Thermoscientific,法国)。


2.4. 脂质体的制备


脂质体由卵磷脂的提取物制成 使用迷你挤出机通过挤出在冷冻保护缓冲液中 来自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA)。 的提取物 卵磷脂由磷脂酰胆碱 (73%) 和 磷脂酰乙醇胺 (11%) 和少量成分,包括甘油三酯和鞘磷脂。 提取物在 冷冻保护缓冲液在脂质浓度为 分别为 3.90 mg mL-1 (C1)、7.28 mg mL-1 (C2)、14.56 mg mL-1 (C3) 和 21.84 mg mL-1 (C4)。 然后对分散液进行超声处理 在超声波浴(来自德国辛根 Elma 的 Elmasonic S 30H,功率为 275W)中持续 15 分钟。 最后,分散是 在挤出机中挤出(20 次通过 100 nm 膜)。 分布尺寸以 120 nm 为中心,Zeta 电位 值为 -6 mV。 在 BSP 存在下引入的脂质体量以重量表示(1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg 和 6.55 mg 脂质,用于脂质体分散体 C1、C2、C3 和 C4 分别)。 不确定度为 0.01 毫克。


2.5. 电泳


十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 在还原条件下进行。 开创性的 将血浆溶解在由 Tris 0.5 M 组成的 pH 6.8 缓冲液中, SDS 10%、甘油 30% w/w 和溴酚蓝 0.4% 得到 1 mg mL-1 溶液。 9% 巯基乙醇 v/v 是 加入样品,涡旋混合,随后加热至 95°C 5 分钟。 那么,10 ? L 低范围分子量 标准(来自 Euromedex、Souffelweyersheim、 法国) 和 10 到 25 ? L 精浆装载在 15%- 聚丙烯酰胺凝胶(pH 6.8-Tris 0.5 M 和 SDS 0.10%)偶联 使用由 Tris 0.025 M、甘氨酸组成的 pH 8.3 迁移缓冲液 0.192 M,SDS 0.1%。 电泳在 20 mA 下进行, 凝胶用考马斯蓝 G250 溶液染色。 染色的 最后扫描凝胶并评估峰的强度 通过 Multi Gauge 软件(2.0 版,Fuji Photo Film Co., Ltd., 日本)。


2.6. 表面活性测量


测量吉布斯膜(通过从精浆溶液扩散到空气-缓冲液界面而形成)的表面张力 在 15 孔板(铝底多孔板,带有 Teflon 轮辋)安装在朗缪尔天平(微槽 XL-LB,Kibron Inc., Helsinki, Finland)配备高灵敏度传感器(使用合金线的威廉米法)。 该设备被放置在一个 温度控制区域固定在 23°C,并用纯蒸馏水校准(Milli-Q 系统,Millipore,美国)。 测量精度为 0.1 mN/m。 精浆被放置在 第一个孔然后在下一个孔中稀释 2 倍,依此类推(每个 井的体积为 300 ? L)。 重复测量 每种精浆提取物 4 次 (n = 2)。 结果是 表示为所有测量值的平均值。


在配备传感器的先前朗缪尔槽上测量蛋白质膜的压缩等温线 (微槽 XL-LB,Kibron Inc.,赫尔辛基,芬兰)。 开创性的 血浆首先在冷冻保存的缓冲液中稀释(1/100) 并在缓冲液表面逐滴(50 升)展开。 这 在平衡 20 分钟后和在室温 (23°C) 下记录压缩等温线。


2.7. 外叶脂质结构域的重建 精子膜


精子外叶的脂质结构域 如前所述[35]重建膜。 这 Langmuir 槽 (302LL, Nima Technology, UK) 被插入一个 自制手套箱放在防震台上并冲洗 用氩气防止脂质氧化。 测量表面压力 使用由过滤器制成的 Wilhelmy 板,精度为 0.1 mN/m 纸(Whatman 的无灰 Whatman 色谱纸) International Ltd., Maidstone, Kent, UK) 连接到一个电 平衡。 环境温度固定在 20℃。 所有烧瓶 和注射器被引入手套箱,然后 在铺展单层之前用氩气脱气 1 小时。 朗缪尔天平的温度是恒温控制的 通过设置在 40 ℃ 的循环水系统。 真实温度 缓冲液表面的温度为 34°C。 子阶段包括 冷冻保护介质。 胆固醇、鞘磷脂、P-PC (18:0/22:6) 和 PC (16:0/22:6) 的氯仿溶液 适当的摩尔比(31:14:16:39)逐滴展开 到缓冲子阶段 25 ? L 微量注射器(精确到 0.5 ? L)(Hamilton Bonaduz AG,Bonaduz,瑞士)。 在压缩之前,让单层平衡 10 分钟 以 40 cm2/min 的屏障速度启动。 一旦达到目标压力 (25 mN/m),压力就会保持不变 通过使用可移动障碍物调整表面积来保持恒定。 由于单层在 30 mN/m 下随时间不够稳定 这是与脂质堆积密度相关的薄膜压力 双层 [36],我们将目标压力降低到 25 mN/m,其中 单层更稳定(见结果)。


一旦达到目标压力 (25 mN/m), 在引入解决方案之前保持 1000 s 生物分子(低密度脂蛋白、BSP 或脂质体)进入亚相 弯针注射器。 针远离尖端弯曲 躺在槽的底部,以便注射 在压缩亚相之下执行。 等量的体积(每种添加剂 0.3 毫升)之前被移除 障碍。 注入生物分子后,面积变化 监测每个脂质分子并表示为变化 相对于初始值 (A/A= (A−A(t0)) × 100/A(t0))。 它有 被跟踪了 3000 秒,时间对应于处理 冷冻保存前的精液。 在这种恒压模式下, 生物分子插入脂质单层导致 通过增加而降低的薄膜压力的增加 表面积。 反之,表面积减少 生物分子导致脂质单层溶解在亚相中。 重复所有数据,偏差不超过5% 的表面积。

图 1. 从牛精液中分离的精浆的 SDS-PAGE 凝胶和 以不同浓度沉积:泳道 1:1 ? G; 车道 2:2 ? G; 车道 3:5 ? g和车道 4:10? G。


2.8. 低温透射电子显微镜 (cryo-TEM)


使用cryoplunge冷冻固定装置(Gatan,USA)制备冷冻TEM观察标本,其中一滴 将水悬浮液沉积在辉光放电的多孔型碳涂层网格(Ted Pella Inc.,美国)上。 TEM 网格是 然后通过吸干含有样品的液滴来制备 支撑碳膜中的孔中保留有薄薄的液体层。 通过快速插入网格使液膜玻璃化 转化为由液氮冷却的液态乙烷。 玻璃化标本安装在 Gatan 910 标本架(Gatan,美国) 使用 CT-3500-cryotransfer 插入显微镜 系统(Gatan,美国)并用液氮冷却。 透射电镜图像 然后从保存在玻璃冰中的标本中获得 悬浮在支撑碳基板上的孔中。


在低剂量条件下观察样品 (<10 e-/A2),-178 ℃,使用 JEM 1230 'Cryo' 显微镜(Jeol, Japan) 在 80 kV 下运行并配备了 LaB6 灯丝。 全部 显微照片记录在 Gatan 1.35K × 1.04K × 12 位 ES500W CCD 相机。 采集了 50 多张图像系列 对于来自多个样品制备的每个样品,具有不同的 放大倍数,以确保观察的良好重复性。



应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——摘要、简介

应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——材料与方法

应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——结果与讨论

应用不同组装的磷脂酰胆碱对牛精浆蛋白的隔离——结论、致谢!