2结果与讨论

2.1乙酰化SLs和去乙酰化SLs组分

2类SLs同系物HPLC-MS/MS鉴定结果表明，乙酰化SLs含有14种同系物（图1A），去乙酰化SLs具有16种同系物（图1B）。

图1乙酰化SLs（A）和去乙酰化SLs（B）的HPLC-MS/MS总离子流图

相比较而言，去乙酰化SLs同系物的保留时间较短，说明这些同系物的极性增大。其中，乙酰化SLs同系物的总离子流图（图1A）中保留时间为23.6 min处的峰的丰度最高，质量分数为42.47%，其质谱碎片如图2A所示。质荷比（m/z）为689.3754的峰为具有C18∶1单不饱和脂肪酸部分的二乙酰化内酯型SLs的分子离子峰，m/z 711.3576为［M+Na］+峰，m/z 671.3644和653.3537分别为［M+H］+失去1个水分子和2个水分子的峰，m/z 485.3113和467.3006分别为［M+H］+失去1个己糖环和再失去1个水分子的峰。上述分析表明，保留时间为23.6 min的组分为带有单不饱和度的C18脂肪酸链的双乙酰化内酯型SLs，即，17-L-［（2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基）-O-］-十八碳烯酸-1，4-内酯-6′，6″-二乙酸酯。

图2（A）乙酰化SLs保留时间为23.6 min组分的质谱图.（B）去乙酰化SLs保留时间为20.3 min组分的质谱图.（C）去乙酰化SLs保留时间为9.4 min组分的质谱图.（D）去乙酰化SLs保留时间为7.6 min组分的质谱图

在去乙酰化SLs同系物的总离子流图中，保留时间为20.3 min的峰具有最高的丰度，达到16.96%，所对应的质谱碎片如图2B所示，其中，m/z 597.5090为［M+H］+峰，m/z 619.4906为［M+Na］+峰，该组分与保留时间为9.4 min的组分具有相同的［M+Na］+和［M+H］+峰（图2C），推测这2种组分可能为同分异构体；对于保留时间为9.4 min的质谱图（图2C），其中，m/z 619.3302和597.3479分别为［M+Na］+峰和［M+H］+峰，而m/z 435.2949和273.2423分别是［M+H］+失去1个和2个去乙酰化的己糖环（C6H10O5）形成的，m/z 273.2423（C16H33O3）是质子化的C16∶0羟基脂肪酸。上述分析表明，保留时间20.3和9.4 min的组分分别为ω型和ω-1型C16∶0的去乙酰化酸型SLs，即16-L-［（2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基）-O-］-十六酸和15-L-［（2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基）-O-］-十六酸。

去乙酰化SLs保留时间为7.6 min质谱（图2D）中的离子m/z 1011.4614和m/z 989.4785分别为某组分的［M+Na］+峰和［M+H］+峰，［M+H］+峰连续失去2个己糖环基团得到离子m/z 827.4266和m/z 623.3640，然后继续失去1个单乙酰化己糖环基团得到离子m/z 461.3102，最后再失去1个己糖环基团得到离子m/z 299.2577。离子m/z 299.2577（C18H35O3）是质子化的羟基脂肪酸Y0，说明该SLs分子为bola型且含有C18∶1羟基脂肪酸。综上推测该组分为C18∶1的单乙酰化bola型SLs。

表1、表2和图3分别显示了乙酰化SLs和去乙酰化SLs的同系物组分及3种有代表性的同系物结构图，从表中可以看出，乙酰化SLs的亲水基主要为双乙酰化的槐糖，双乙酰化组分高达92.50%；疏水基以十八碳的疏水基为主，其中十八烯酸疏水基质量分数为47.95%；内酯类型的SLs质量分数为97.86%。去乙酰化SLs同系物中的疏水基中十八烯酸质量分数最高，达到27.87%，亲水基主要为去乙酰化的槐糖，质量分数为90.56%，即使发酵菌株被敲除了乙酰化关键基因，该产物中仍然有9.44%的单乙酰化槐糖脂，可能胞内存在其他低效率的乙酰化途径，具体原因有待进一步研究。去乙酰化SLs同系物中含有内酯型、酸型和bola型SLs，质量分数分别为26.99%、49.98%和23.03%；而乙酰化SLs同系物中以内酯型为主，质量分数达到97.86%，酸型同系物质量分数为2.14%，未发现bola型SLs。这是由于乙酰化SLs菌株和去乙酰化SLs菌株对底物的代谢途径和效率不同。乙酰转移酶基因AT的敲除使大部分SLs分子不再发生乙酰化。在去乙酰化SLs产品中bola型SLs分子质量分数高达23.03%，与Saerens等的研究结果一致。

这是由于乙酰转移酶基因AT的缺失触发了bola型SLs的大量合成，去乙酰化SLs同系物上葡萄糖基转移酶Ⅰ和Ⅱ作用于酸型SLs的羧基端进行糖基化，使其额外连接2个葡萄糖，生成bola型SLs，而乙酰化结构的SLs则不能发生这种途径的糖基化反应。以上结果表明，去乙酰化SLs菌株所产SLs以非乙酰化的酸型SLs为主，并能够合成bola型SLs，具有比乙酰化SLs产品更丰富多样的同系物结构。

表1乙酰化SLs同系物组分和质量分数(Continued from previous page)

表2去乙酰化SLs同系物组分和质量分数(Continued from previous page)

图3 3种有代表性的槐糖脂结构式：（A）双乙酰化内脂型槐糖脂；（B）去乙酰化酸型槐糖脂；（C）去乙酰化bola型槐糖脂