2结果与讨论

2.1胶原蛋白肽的制备

完整的胶原是具有三螺旋结构的原胶原分子，形成独特的纤维结构，交织成坚固的网络，提供结缔组织的承受力。这样的胶原是难以溶解的，也无法覆层至羟基磷灰石材料表面，因此必须对其进行降解，为覆层提供材料。

为实现胶原蛋白肽分子量可控均一，分别比较了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶的酶解效果，在酶本身最适pH条件下，酶解至分子量不发生明显变化，检测其酶解后分子量分布(分子量计算依据图1中的标准曲线)，结果见表1。从表中结果可以看出不同的酶对胶原蛋白的酶解效果不尽相同，然而均未能达到控制其分子量在200~5 000 Da的预期效果。胰蛋白酶酶解速度最快，1 h酶解结束，而碱性蛋白酶是这几种蛋白酶中酶解后分子量最小的。因此，将这2种最适pH为8.0的蛋白酶混合，经条件优化发现胰蛋白酶。碱性蛋白酶为2:5时，2种酶同时作用可以在1 h内将胶原蛋白酶解至200~5 000 Da(凝胶过滤色谱检测结果见图2)。碱性蛋白酶酶切位点为Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Try，胰蛋白酶酶切位点为Arg、Lys，这2种酶的酶切位点无重叠，从而在酶解过程中协同作用，实现了快速高效酶解。

图1多肽分子量计算标准曲线

图2胶原蛋白肽凝胶过滤色谱分析

表1酶解效果表

2.2胶原蛋白肽LB膜的制备

用LB膜分析仪研究了胶原蛋白肽LB膜的表面压-面积曲线，如图3所示。当胶原蛋白肽氯仿溶液被滴加在亚相表面上，随着氯仿在亚相表面的铺散，胶原蛋白肽呈分散状态，分子间距较远，单分子所占面积大，呈现出LB膜制备过程中气相状态特点，表面压几乎为零。在氯仿溶剂挥发干净后，随着滑障的压缩胶原蛋白肽分子互相靠近，单分子所占面积变小，当分子间距离缩短至液相状态，可以检测到表面压开始缓缓上升。继续压缩，亚相表面上的胶原蛋白分子由液态向固态转变，分子间距快速减小，表面压快速上升，此时形成固相状态的单分子膜，分子之间排列紧密。继续压缩，可以使分子间距到达最小值，表面压升至最高，即为其崩溃压力，再压缩则形成的单分子层会瞬间崩溃。经图3结果中可以看出，胶原蛋白肽的成膜过程符合标准朗格缪尔膜成膜过程的相关特性，其崩溃压力为23.8 mN/m，维持表面压为23 mN/m，可以得到稳定的胶原蛋白肽单分子层，实现LB膜的固相转移，制备胶原蛋白肽覆层羟基磷灰石材料。

图3面积-表面压图像

2.3覆层羟基磷灰石材料性能研究

2.3.1 AFM表征

利用AFM对胶原蛋白肽覆层羟基磷灰石材料性质进行研究(结果见图4)。从图4中的AFM 3D图像中可以看出转移至羟基磷灰石表面上的胶原蛋白肽LB膜性质良好，形成的单分子层呈平铺状态，分子分散均匀，厚度相对均匀，经估算单层厚度约为3.1 nm，2层厚度为5.7 nm，3层为8.9 nm，4层为11.7 nm。通过软件测得单层胶原蛋白肽LB膜表面粗糙度Ra(轮廓算术平均偏差)为0.9 nm，表明膜的表虽不完全平坦，但相对均匀。这表明通过LB膜技术可以制备出胶原蛋白肽覆层的羟基磷灰石材料，并且可以根据需求制备单层、双层、多层的覆层材料，满足不同应用需求。

图4空白羟基磷灰石材料与覆层材料AFM 3D图像

2.3.2材料稳定性

通过用生理盐水对材料进行浸泡、多次冲洗，检测覆层4层羟基磷灰石材料中胶原蛋白肽的泄露，来评价生物覆层材料的稳定性。对收集的浸泡液、冲洗液浓缩100倍，通过微量Lowry法检测其蛋白浓度，在浸泡液中未检出胶原蛋白肽，冲洗液检测结果见表2。从表中结果可以看出随着冲洗次数增多，泄露的胶原蛋白肽呈现先增加后减少的趋势，说明覆层的胶原蛋白肽会有一定的脱落，但不会一直脱落，经折算，脱落胶原蛋白肽总量仅占覆层总量的0.01%，因此制备的覆层材料是稳定可靠的。

表2冲洗液检测结果表

2.3.3力学性能

对羟基磷灰石和覆层材料的杨氏模量进行了测量，结果如图5所示。空白的羟基磷灰石材料的杨氏模量为3.14±0.16 MPa，随着覆层层数的增加杨氏模量逐渐增加，最高可达6.21±0.18 MPa，说明胶原蛋白肽的覆层能够有效地改善羟基磷灰石材料的力学性能，提高其杨氏模量。

图5不同材料的杨氏模量

2.3.4生物性能

MC3T3-E1细胞在羟基磷灰石和覆层材料上培养5天的增殖情况见图6。因结果类似，图中仅列出了单层和4层覆层材料的增殖结果，可以看出在覆层材料上MC3T3-E1细胞增殖要优于空白羟基磷灰石材料，表明所制覆层材料不仅无细胞毒性，而且因胶原蛋白肽的优良生物相容性，能一定程度上促进细胞增殖。所用的羟基磷灰石和胶原蛋白肽都是经过实践证明的生物相容性良好的材料，其对材料生物性能的提升作用是由其本身的生物相容性良好引起的，因此覆层层数对生物性能提升作用不明显。

图6不同材料细胞培养情况

3结论

1)本文建立了一种制备胶原蛋白肽覆层材料的新方法，利用LB膜技术将胶原蛋白肽覆层至羟基磷灰石上，制备了一种新型覆层生物材料。

2)通过碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合作用实现了均一分子量胶原蛋白肽的制备。将胶原蛋白肽覆层至羟基磷灰石片上，通过AFM表征发现膜的表面平整，单层厚度约为3.1 nm。

3)制备的材料性能稳定，能有效提高羟基磷灰石材料的力学性能，生物相容性良好，能促进细胞增殖。进一步可以通过化学交联提高覆层的稳定性，为新型医用生物材料开发提供借鉴。