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分子表面包装对于磷脂单分子层膜中的锚定蛋白中酶活性的调制作用的影响——材料和方法

来源:上海谓载 浏览 177 次 发布时间:2021-12-01

材料和方法


所有溶液均使用无热原Milli-Q水(微孔)制备。 从西格玛化学公司购买了HPLC级三苯醚、聚氧乙烯基-9-月桂基醚、C12(EO)9、二吡啶基磷脂酸(DMPA)、2-氨基-2-甲基丙烷-1-醇(AMPOL)、对硝基苯磷酸酯(PNPP)和异硫氰酸荧光素。从默克公司获得氯仿、甲醇和氯化镁。 所有其他试剂均具有最高的市售纯度。


碱性磷酸酶的制备。 该酶由富含碱性磷酸酶的大鼠骨板膜制备。37个膜结合碱性磷酸酶(0.2 mg/mL)样品在25°C条件下,在恒定搅拌下,用1%(最终浓度)C12-(EO)9(polidocanol)溶解2 h。 在30000g离心2h后,将溶解洗涤剂形式的碱性磷酸酶(DSAP)浓缩在YM-5 Amicon过滤器上,并用5mmol透析过夜 ● L-1 Tris“HCl缓冲液,pH值7.5,含2 mmol ● L-1 MgCl2,150 mmol ● L-1氯化钠和0.01%(v/v)聚二十二烷醇。 最后,在Sephacryl S-300柱(130×1.7cm)上纯化DSAP,在相同的缓冲液中平衡和洗脱。 在非变性条件下纯化酶的聚环丙酰胺凝胶电泳38显示出与酶活性一致的单一蛋白带。 在均相溶液中PNPP水解时测得的纯化DSAP的比活性为1482.0 nmol的PNP-“min-1”mg-1(PNP-)对硝基苯酚(PNPP的水解产物),在先前报告的范围内。39在0.01%(v/v)的存在下,将酶保持在碎冰中 polidocanol的有效期为1个月,没有明显的活性损失。


朗缪尔单分子膜和表面压力面积等温线。 纯DMPA和DMPA/DSAP混合单分子膜的制备方法是将其溶液(20µL用于1×10-3 mol L-1 DMPA,100µL用于7.3µg/mL DSAP)分散在槽(芬兰Kibron,体积为70 mL,总面积为115 cm2)中包含的亚相上,并由2 mmol组成 ● 50 mmol中的L-1 MgCl2 ● L-1氨酚缓冲液,pH 9.4(DSAP催化活性的最佳值),导致初始零表面压力。 DMPA溶液在氯仿/甲醇混合物(3:1)中制备,如别处所述。40对于脂质/蛋白质混合单层,DSAP溶液在5 mmol中制备 ● 含有2 mmol的pH值为7.5的L-1 Tris“HCl缓冲液 ● DMPA单分子膜形成后,在界面扩散L-1MgCl2和0.01%polidocanol(DSAP储存的最佳条件),在混合单分子膜中提供6.12 ng/cm2的初始酶表面密度(以1:3500的摩尔比例,蛋白质/脂质)。 大约10-15分钟用于表面压力稳定、溶剂蒸发和单层组分的横向扩散。 然后通过使用侧向屏障压缩单层(纯或混合),直至达到塌陷。 为了比较纯脂质和混合蛋白质/脂质单层的曲线,将两种等温线记录为平均脂质分子面积的函数。 单层实验在37±1°C下进行。


为了测试非离子表面活性剂的影响,记录了在2.5×10-7mol/L聚对苯二甲酸乙二醇酯水溶液上DMPA单层的等温线。 这实际上与在纯水上得到的DMPA一致。


酶活性。 在形成DSAP/DMPA混合单层后,界面被压缩,直到达到所需的表面压力。 将浓缩PNPP溶液注入亚相,以达到1 mmol的最终浓度 ● L-1(酶饱和条件)。 在37°C下,通过测量反应产物对硝基苯酚离子(E 410nm,pH9.4)17600 mol“L-1”cm-1的吸光度,在亚阶段监测底物水解。 这些测量是通过二极管阵列分光光度计(Spectropete,世界精密仪器公司,美国)的采样微升尖端完成的。 该测量装置由一个位于微移液管顶端的特殊微室组成,该微室配有一根发射收集光纤和一个微插入器。 在整个实验过程中,在连续搅拌下,微细胞尖端直接浸入单层亚相。 在适当的时间间隔内,自动提取约2µL亚相的等份,并通过计算机记录整个吸收光谱进行分析,然后将提取体积返回亚相,保持槽体积恒定。


在没有酶或单层的情况下进行对照实验,以确保估计的酶活性完全是由于界面上存在的酶。简而言之,实验中使用的槽有三个隔间,通过狭缝从一侧连接到另一侧(0.5 mm宽,2 mm长,0.2 mm深)在接口水平面。因此,有两个“横向”隔室和一个“中央”隔室。隔室的墙壁防止“通信”在亚相之间,我们可以认为它们是孤立的。DMPA和酶在槽上扩散,并在一定时间内(20分钟)扩散。允许溶剂蒸发和平衡。之后,使用两个横向屏障压缩混合单层,将其限制在中央隔室的界面上。然后将底物PNPP注入三个隔室的亚相,并通过监测ab测定所有隔室中的酶活性PNPP水解产物的吸附性。对照实验也在均相介质中进行,使用1mmol●L-1 PNPP和2 mmol●50 mmol中的L-1 MgCl2●L-1 AMPOL缓冲液,pH值9.4(酶活性评估和底物饱和的最佳条件)。Langmuir单分子膜的酶活性以溶液中测定的百分比表示(约1480 nmol PNP-“min-1”mg-1酶)。


在玉兰油玉兰油玉兰油(Paulo)、巴西RieBiRa Pro to Pror大学的实验室中,用荧光显微镜(OLYBUS B-MAX)获得了混合单分子层的荧光显微照片。配备高灵敏度SIT摄像机(滨松C-24).使用透析共轭技术41用异硫氰酸荧光素标记的DSAP作为荧光探针。考虑到标记可使蛋白质变性,仅1 mol%的标记蛋白质与天然DSAP混合,这足以在空气/水界面识别富含蛋白质的结构域。


分子表面包装对于磷脂单分子层膜中的锚定蛋白中酶活性的调制作用的影响——摘要、介绍

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