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Delta-8食用餐食后人体内十二指肠液的组成及性质——摘要、介绍、材料和方法

来源:上海谓载 浏览 229 次 发布时间:2022-01-10

摘要


本研究的目的是评估三种营养状态下十二指肠成分的变化:禁食、喂养和高脂肪喂养状态。健康受试者在非连续日服用两次等热量膳食。随后,每30分钟采集一次十二指肠样本,然后根据pH值、脂解产物、胆汁盐、磷脂、渗透压和表面张力对其进行表征。由此产生的时间曲线显示出波动模式,反映了受试者之间和受试者内部的高度可变性。高脂肪液体餐的高脂肪百分比不会改变十二指肠成分。单甘酯占总脂质的5%至88%,是主要的脂肪分解物质,其次是游离脂肪酸。在给药后30分钟内,禁食、喂食和高脂喂养状态下,个体十二指肠内脂质产物浓度分别为0.0–5.5、1.0–14.9和3.1–22.4 mg/mL。胆汁盐的相应值分别为2.0–9.0、6.9–9.3和4.4–30.3 mM,磷脂的相应值分别为0.06–2.4、2.6–5.7和1.4–9.3 mM。但没有发现具体的趋势。这项研究说明了摄入食物后可能导致的可变腔内条件。由于十二指肠内事件(如十二指肠内溶解)影响水溶性差和/或高度亲脂性药物的吸收,这种变异性可能导致经常观察到的高度可变的药物血浆时间曲线。


介绍


肠腔内药物浓度是决定药物跨肠上皮转运的关键因素之一。最近有报道直接测量腔内药物浓度;1-3然而,这与各种困难有关。因此,基于体外溶解度测定的腔内药物浓度评估将是一种更实用的方法。4.


迄今为止,普通水缓冲液通常用于药典溶解度测定。由于这些简单的缓冲系统在生理上不相关,它们的使用可能导致低估小肠中的溶解度,尤其是对于水溶性差和/或高度亲脂性药物。作为小肠内容物替代物的新培养基很难定义,因为肠腔的成分是各种因素(包括pH值、胆汁分泌和食物消化产物)相互作用的结果。在过去的十年中,为了更好地反映体内情况,已经做出了一些努力来提高溶解度和溶出度测定的生物相关性;最常用的替代品是禁食状态模拟肠液(FaSSIF)和喂食状态模拟肠液(FeSSIF)。5–9尽管进行了多次尝试,但对当前使用的生物相关介质的评论仍定期发表,包括对缓冲系统的评论,与胆盐混合物相比,使用单一胆盐种类,以及没有脂质消化产物。8,10,11此外,近年来对胃肠道环境组成的了解有所增加,尤其是在美联储国家。11–13进餐后,膳食甘油三酯水解为单甘酯和游离脂肪酸,主要是通过十二指肠中的胰脂肪酶作用。众所周知,这些分解脂肪的消化产物可以对高度亲脂性化合物的溶解性产生积极影响。7,14–16这一知识已成功应用于脂基给药产品的配方中,以提高腔内药物浓度。17该信息还导致了一些研究,其中评估了生物相关培养基中脂质产物,尤其是脂肪酸和单甘酯的掺入情况。7,14,16,40然而,到目前为止,尚未就优先使用的脂质消化产物的浓度、类型或链长达成一致。此外,我们应该意识到腔内环境在不断变化,特别是在进食后:进入的食糜会影响十二指肠的pH值;神经和激素信号刺激胆囊收缩、胰酶流动和肠道运动。这一过程是由胃和十二指肠中存在的膳食营养素,特别是脂解产物引起的。因此,酶复合物脂肪酶-大肠杆菌酶从脂滴表面释放单甘酯和游离脂肪酸,随后可作为胆汁成分形成的混合胶束的一部分被吸收。18


为了进一步提高模拟肠液(SIF)的预测能力,需要对人体肠液(HIF)进行深入的表征。由于对进食后小肠环境的了解相当有限,11,12,19我们考虑了受试者间的变异性,研究了进食后时间功能中HIF的组成和特征。此外,通过给药不同脂肪百分比的营养饮料来评估不同喂养状态的效果。


材料和方法


材料


NaCl、冰醋酸、氯仿、甲醇、己烷和吡啶购自默克公司(德国达姆施塔特)。硅烷化剂双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)从皮尔斯(伊利诺伊州罗克福德)获得。脂质DL-a-棕榈酸、1,2-二棕榈酰-rac-甘油、甘油基三棕榈酸和棕榈酸以及通用脂肪酶抑制剂奥利司他从Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)购买。使用Maxima系统(Elga有限公司,英国High Wycombe Bucks)净化水。


确保使用Plus1(荷兰Zwolle的雅培实验室B.V.)模拟标准膳食。200ml的一部分能量含量为300 kcal,其中脂质、碳水化合物和蛋白质分别占29%、54%和17%;渗透压为670mosm/kg;pH值为6.6。ScandishakeMix1(英国利物浦Nutricia)被用来模拟富含脂肪的膳食。按照制造商的指示制备后,一份的体积为300 mL,总能量为600 kcal,能量基础上由46%的脂质、46%的碳水化合物和8%的蛋白质组成;渗透压为1031mOsm/kg,pH值为6.7。


HIF的取样


肠道液体的取样在鲁汶大学医院进行,并得到医学伦理委员会(ML3242)的批准。五名健康的白人志愿者在给予书面知情同意后被纳入研究。在典型的生物利用度/生物等效性研究中选择志愿者。三名男性和两名女性志愿者,年龄在21至37岁之间,体重指数在22至25 kg/m2之间,参与了这项研究。没有一名志愿者有胃肠病病史,并且在参与研究前7天没有服药。


经过一夜禁食后,通过口腔将一根双腔导管(塞勒姆集水坑管14 Ch,外径4.7 mm,Sherwood Medical,Petit Rechain,比利时)引入十二指肠(D2–D3),并通过透视检查其位置。这种双腔导管允许通过注射器收集肠液,而不会在胃肠道(GI)中产生负压。以前有报道称,经幽门管的存在不影响胃排空或十二指肠胃反流。20在三个非连续的日子里,志愿者在取样前要么喝营养饮料要么只喝规定量的水(250毫升)。后者被称为禁食状态。为了模拟一顿标准餐,摄入400毫升的水和250毫升的水。这种情况称为美联储状态。通过摄入300毫升斯堪的纳克混合物1,然后摄入350毫升水,以获得650毫升的总体积,从而获得脂肪丰富的喂养状态。在摄入营养饮料和/或水之后,在2小时(禁食状态)或5小时(喂食状态和富含脂肪的喂食状态)内,每15分钟对肠液进行一次取样(¼时间点0),以便在整个收集期后,获得21份喂食和富含脂肪的喂食状态和9份禁食状态。在含有溶于乙醇的奥利司他的试管中收集肠道样本,以阻止体外进一步的脂肪分解。使用1 mM奥利司他在乙醇中的储备溶液使十二指肠样品中奥利司他的最终浓度达到1 mM。该方案允许对采集的样品进行少量稀释,并可忽略添加乙醇(0.1%,v/v)。如前所述,该脂肪酶抑制剂的应用浓度为IC50(11 nM)的100倍(联合利华食品与健康研究所,弗拉丁根,数据未公布);样品的成分可视为体内成分的代表。在每个采集时间点之后,用5–10 mL空气冲洗导管,以清洁导管,以便随后进行抽吸。在冰上收集所有吸入的液体,在4000 rpm和48℃下离心20分钟,并测量上清液的pH值(瑞士博纳杜兹汉密尔顿Slimtrode)。所有样品在308C下储存,直至进一步分析。


样品的处理


为每位志愿者成对收集的分数,以获得30分钟的分数,因此对于大多数分数,有足够的体积可用于执行所有所需的分析。除了成对的混合组分外,通过添加等量的所有组分,为每位志愿者分别制备一个整体混合样品(进一步称为混合样品),受试者2和受试者5的禁食状态除外(没有足够的体积可用)。


样品分析


酸碱度


上清液的pH值(见HIF部分的取样)在收集后立即测量(Hamilton Slimtrode)。


渗透压


渗透压(马萨诸塞州诺伍德市先进仪器公司;3250型)是根据测定250毫升样品体积中的冰点降低进行评估的。


表面张力


使用Delta-8多通道微张力计(芬兰赫尔辛基Kibron公司)在室温下测定表面张力。将50微升HIF添加到96孔板的每个孔中。相应的表面张力值由g-screen软件根据从溶液中取出金属丝探针时测量表面张力施加的力自动生成。


胆汁酸


根据羟基的数量、位置和方向测定胆汁酸。在碱性水解和酸化后,用二乙醚提取游离胆汁酸,然后进行三甲基硅烷化以进行GC-MS选择离子监测分析。21胆汁酸的色谱分离在DBXLB毛细管柱上进行,恒流模式为0.8 mL/min,最终温度为2908℃,载气为氦气。


以氘标记的胆汁酸作为内标物。总胆汁酸浓度测定为单独测定组(胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、去氧胆酸盐、熊去氧胆酸盐)的总和。


总磷脂


使用Wako Chemicals(Neuss,德国)的试剂盒通过酶法测定总磷脂水平。22磷脂酶D释放后,胆碱被胆碱氧化酶氧化,产生过氧化氢。随后,过氧化物酶的作用导致红色醌的形成,可通过分光光度法进行分析。


脂质含量


按照Armand等人12的方法提取1ml冻干十二指肠液中的脂质。简单地说,冻干样品溶解在含有2%冰乙酸的0.15m NaCl中。以氯仿/甲醇(2:1,v/v)为萃取溶剂。下部氯仿层在氮气流下蒸发至干燥。使用BSTFA(2%吡啶,v/v)将残余物硅烷化。在608C下30分钟后,将样品溶解在己烷中,并根据Duchateau等人23所述的技术,通过GC[Fisons MFC800]和火焰离子化检测进行分析。所使用的色谱柱为Chrompack CP-Sil5CB-MS色谱柱,带有失活的熔融石英预柱。样品被注入“冷柱”,并以108C/min的升温速率加热至3608C。氢气被用作载气。注射量为0.5 mL,总运行时间为50 min。根据碳数(CN)分离脂质。出于我们的目的,对各峰进行单独整合并组合,以获得每类中性脂质的一个AUC值。CN 8-18、CN 20-28、CN 30-42、CN 44至end范围内的峰值分别指定为游离脂肪酸(FFA)、单甘酯(MG)、甘油三酯(DG)和甘油三酯(TG)。选择这些整合范围是为了尽量减少不同脂质类别之间的重叠。使用各自的校准曲线计算每一类的量:将棕榈酸、单棕榈酸、双棕榈酸和三棕榈酸标准品溶解在己烷中,并在氮气下蒸发适当体积,以获得各自标准品的已知量。提取残余物并与未知样品进行相同的硅烷化。


数据分析


每个主题的所有配置文件均单独呈现;只有当无法吸入液体或没有足够的液体进行分析时,数据点才被忽略。个人中值是指1名受试者在1种营养状态下的中值。综合考虑所有五名受试者在一种特定营养状态下的数据,计算出总体中值。使用重复测量ANOVA结合Tukey多重比较检验或配对t检验对数据集进行比较。根据梯形规则计算喂食和富含脂肪的喂食状态下总胆汁酸和磷脂的AUC0–300 min值。对于禁食状态,AUC0–300分钟值是通过假设禁食个体中值是管腔内值的客观估计值来估计的,因为禁食状态在给药后/给药后300分钟内保持不变。在所有病例中,p<0.05时的差异具有统计学意义。