全球领先的表面张力仪测量技术——精确快速测量动静态表面张力

热线:021-66110810,66110819,66110690,13564362870 Email: info@vizai.cn

荣誉客户/Honor customers

               

拜耳公司

               

同济大学

                

联合大学

                

美国保洁

                

美国强生

               

瑞士罗氏

当前位置首页 > 新闻中心

不同膜压下钙诱导的磷脂排序研究——结果和讨论

来源:上海谓载 浏览 81 次 发布时间:2022-06-22

结果和讨论


首先,给出了从表面压力测量中获得的压缩等温线,揭示了水、钠和钙溶液中脂质单层之间的宏观差异。然后,我们使用荧光显微镜沿着压缩等温线观察了结构域的形成,并跟踪了当Ca2+离子结合到单层时结构域的变化。最后,利用VSFG在分子水平上阐明了阳离子-脂质相互作用。


压缩等温线。图2显示了DPPC和DMPS单分子膜在不同亚相(净水、1 M NaCl和1 M CaCl2溶液)上的Langmuir等温线。对于此处使用的1 M NaCl和1 M CaCl2溶液,亚相中的氯离子浓度不同。由于氯离子与磷脂的配位作用较弱,因此可以忽略因氯离子浓度不同而产生的11种可能影响,这已通过使用0.5 M CaCl2溶液的对照实验得到证实。

图2:DPPC(A)和DMPS(b)在不同亚相上的压力面积(π-A)等温线:净水(蓝色)、1 M NaCl溶液(绿色)、1 M CaCl2溶液(红色)。沿等温线显示了液相膨胀相(LE)、液相凝聚相(LC)和两相共存区(LE+LC)。ACa2+代表钙离子的面积。


在水上,DPPC的相行为已被充分记录。23,25随着表面积的减小,已确定以下区域:气相、液相膨胀(LE)相、LE和液相冷凝(LC)相共存的平台特征以及纯LC相。


由于亚相中存在钠离子,DPPC的压缩等温线在LE和LE+LC区域移动到略高的表面压力。之前也观察到了同样的效果30,这可以通过离子结合到LE相引起的脂链紊乱来解释。在较高的表面压力下,钠对压缩等温线没有影响,表明钠离子与LC相没有明显的相互作用:离子可能正从头群区域“挤出”。


对于CaCl2溶液亚相,观察到更显着的效果。在这里,表面压力在低得多的密度下变得有限(∼140Å2/分子),而从LE相到LE+LC共存区的转变不太明显。在LC区域(π>20 mN/m),钙的存在导致脂质占据4Å2/m的额外空间,这正是钙离子的足迹。31这表明,在表面压力超过20 mN/m时,使头部基团水合的水被钙离子取代。在更高的表面压力(>25 mN/m)下,额外面积下降约2Å2/脂。分子面积差异的变化可以用两种方式来解释:(1)从1:1到2:1脂质/Ca2+复合物的转变,正如之前MD模拟所提出的那样;11(2)脂质头基构象的变化。6,23


对于DMP,水上压缩等温线(图2b)显示出与DPPC相同的相行为,具有LE、LE+LC和LC区域。然而,压缩后,每个分子可以达到更小的面积。这表明PS比PC更具可压缩性,这与相邻带电头基团之间的库仑排斥作用应扩大每个PS分子面积的直观表示相反。结果表明,相邻PS头基带电部分的强分子间配位在面积减小中起作用。16


对于1 M Ca2+溶液上的DMPS单分子膜,与观察到的纯水共存区的π)10 mN/M压力相比,LE+LC平台压力降低到π)5 mN/M;在较高的表面压力(π>20 mN/m)下,两条等温线的位移保持等于Ca2+足迹,4Å2/脂,未观察到明显转变为2:1脂/Ca2+复合物。


荧光显微镜。利用荧光显微镜可以观察到脂质单分子膜内的共存相。图3显示了三种典型表面压力下,用荧光探针标记的DPPC和DMPS单分子膜沿等温线获得的荧光图像。暗区对应于有序(LC)畴,亮区对应于无序(LE)畴。对于净水子相(图3中的左列),低表面压力下的LC域为DPPC(图3a)19的“豆”形和DMP的“花”形(图3d)。随着表面积的减少,LC域在凝聚成连续LC相(图3c)之前通过有序脂质的狭窄区域相互连接(图3b)33。从荧光图像分析中获得的有序暗区的归一化面积Adark(图4)表明,LC相在单层压缩后增加,并在π>10 mN/m时覆盖整个单层。

图3:水上DPPC(a、b、c)和DMPS(d)单层的荧光图像(左图)和1 M CaCl2溶液(右图),π)4 mN/M(a)、π)6.5 mN/M(b)、π)35 mN/M(c)和π)2 mN/M(d)。单分子膜用5 mol%罗丹明PE标记:亮区对应于LE相,暗区为LC结构域。比例尺代表15µm。所有图像的对比度都相同。


当钙存在于亚相时,PC和PS单分子膜在低表面压力下都可以观察到小的有序畴。更大面积的单层被这些∼与水相比,Ca2+的有序畴为3.5µm(见图4)。因此,低表面压力下的这些小区域是钙诱导的,它们占据∼表面的30%(对于PC)和20%(对于PS)。从下面的VSFG测量中也可以明显看出这些域的存在。到目前为止,这种钙离子诱导的结构域仅在混合单层系统中观察到。34,35在中等表面压力下(5 mN/m<π<25 mN/m),从图4可以明显看出,Ca2+的作用是降低有序畴的密度。

图4:。在净水(蓝色)和1 M CaCl2溶液(红色)上,DPPC(a)和DMPS(b)单分子膜的荧光图像中暗有序LC域的部分面积Adark随表面压力的变化。注意周围标记的局部最大值∼在存在Ca2+离子的情况下,两种脂质均为3 mN/m。


振动和频发生光谱学(VSFG)。VSFG是一种非线性振动光谱技术,可提供界面分子构象顺序和方向的表面特定信息,进一步研究了在Ca2+存在下这种改变相行为的分子起源。21,22为了量化离子对脂质尾部构象的影响,在C-H拉伸区域收集VSFG光谱。沿等温线测量了几个表面压力的光谱;图5显示了DPPC单层在20 mN/m和35 mN/m下三种不同亚相的光谱。可以观察到五种振动模式:以2876、2970和2938 cm-1为中心的峰值分别归属于CH3对称拉伸、CH3反对称拉伸和CH3费米共振。22 CH2对称和反对称拉伸频率约为2846和2920 cm-1。氘化DPPC脂质单层(d62和d75 DPPC)上的VSFG实验显示胆碱C-H伸展的信号非常低。

图5:。DPPC在π)20 mN/m(顶板)和π)35 mN/m(底板)时的VSFG光谱。垂直线表示亚甲基对称拉伸(νsCH2)和甲基对称拉伸(νsCH3)的位置。所有光谱均归一化为z切石英的参考信号。实线表示使用洛伦兹模型拟合数据。


单分子层压缩后,CH2强度显着降低。这可以从对称性参数中理解:当烷基链中的亚甲基从顺式构象变为反式构象时,会出现一个局部反转中心,从而使CH2模式SFG无效。23另一方面,CH3强度随着单层的压缩而急剧增加,这是由于链倾角的角度分布变窄所致。CH3和CH2对称拉伸振子强度可通过拟合数据获得。考虑到前面的论点,CH3和CH2对称拉伸振子强度的比值R为脂链的顺序提供了一个灵敏的经验度量。24为了可靠地提取R,使用洛伦兹多峰模型对数据进行全局分析(见支持信息中的公式2,实验部分),仅允许峰值振幅随表面压力的变化而变化。DPPC和DMPS的R在图6中绘制为表面压力的函数。



图6:。作为DPPC(a)和DMPS(b)单分子膜表面压力的函数,CH3和CH2对称拉伸振子强度的比值R:纯水(蓝色)、1 M NaCl溶液(绿色)和1 M CaCl2溶液(红色)。由于单分子膜的崩塌,在π)40 mN/m时,无法测定Na+-DPPC的比值R。由于压缩单层膜的νsCH2振幅的不确定性,在较高压力下,误差条较大。插图显示了作为每种脂质面积函数显示的比率R。请注意∼4Å2/脂质置换(解释为Ca2+足迹),与图2中的等温线一致。


对于纯水和NaCl亚相上的DPPC单分子膜,R随压力以类似的方式变化,在钠存在的情况下,R值稍小,但重复性较小。这表明,正如压区等温线也显示的那样,在Na+存在的情况下,DPPC单分子膜的有序性稍差,这与之前关于亚相中高浓度NaCl的报告一致,30但与分子动力学模拟不一致,11,13表明在∼10 mN/m表面压力。


对于含有Ca2+离子的亚相上的DPPC,R在5 mN/m处显示出一个小但可重复的峰值,随后在10到20 mN/m之间略有下降,然后在25 mN/m左右急剧增加。在低表面张力下,按顺序短暂增加(∼5 mN/m)与荧光显微镜的结果非常一致,这表明在这些压力下也会依次增加(图6)。在下文中,我们将尝试使用表面张力测量、荧光显微镜和VSFG测量的结果,提供单层相行为的统一图片。我们将首先讨论DPPC的具体结果,然后讨论DMP。


在VSFG测量中,当探测面积为∼10-2 mm2,但随着单层中平均阶数的增加,R值出现峰值。进一步压缩,诱导域合并成更大的域。同时,Adark增加,但Ca2+仍比水低20%(图4a,10 mN/m<π<25 mN/m)。这再次与VSFG光谱很好地一致,VSFG光谱表明这些表面压力下的脂质尾部更加无序,因为20 mN/m的CH2对称和反对称拉伸在亚相Ca2+中更加突出(图5)。


当表面压力达到25 mN/m时,R急剧增加,达到一个恒定的大值。有趣的是,R的急剧增加与等温线中脂质面积减少2Å2/脂质的位置一致(见图2),我们将其归因于(见上文)从1:1脂质/钙+复合物转变为2:1复合物。这意味着顺序的增加,即R的增加,涉及到由Ca2+-脂质相互作用的明显变化引起的头群的重新排列。当比较Ca2+溶液与纯水时,从R值增加的不同点也可以明显看出与Ca2+离子足迹相关的4Å2/脂质表面积。当绘制R与每种脂质的面积之比时,R的增加精确地移动了一个单位的ACa2+(插图6)。


当Ca2+-DPPC体系(π)25 mN/m的比值R急剧增大时,20%的单层面积仍被LE相覆盖。从VSFG获得的比率R的增加并不是由于脂尾中的笨拙缺陷消失,而是由于LC相中的烷基链朝向链与表面法线之间的较小角度θ重新定向。这可以从νsCH3和甲基反对称拉伸12的振幅之比得出结论(详细信息见支持信息),这表明DPPC在Ca2+溶液中的θ比在纯水中的θ小10°。在这些压力下,钙离子的存在导致脂质向表面法线协同倾斜。


对于DMP,尽管其头基结构和电荷不同,但Na+和Ca2+离子的结果与DPPC的结果非常相似。由于DMPS的非极性烃链长度略短(DMPS为14个碳,DPPC为16个碳),与DPPC相比,DMPS压缩单层的R值较低。先前已经报道了烷基链的长度与单层的相对顺序之间的直接相关性。36


对于Ca2+,DMPS单分子膜的比率R与DPPC单分子膜的趋势相似:在低表面压力下出现峰值(∼3 mN/m),并且在较高的表面压力(π)30 mN/m时会出现急剧增加,ACa2+开始向每个分子的更高面积方向移动(插图6)。同样,这与等温线数据和荧光图像非常一致。对于高表面压力(π>30mN/m)下的DMP,发现R与亚相中钙的存在无关,表明在高压下存在类似的酰基链排序。


可以注意到两种脂质之间的三个差异:首先,在5 mN/m<π<25 mN/m的区域,在荧光结果中,钙诱导的DPPC下降顺序对于DMPS是明显的,但在VSFG结果中则不太明显。其次,DPPC中观察到的从1:1到2:1脂质/钙复合物的转变对于DMPS来说并不明显,尽管ACa2+在荧光和VSFG数据中都出现。第三,虽然钠离子在高压(π>25 mN/m)下诱导两种脂质紊乱,但这种效应对DMP显着更大。目前,我们对这些观察结果没有一个令人满意的解释,除了差异必须源于集团结构的差异。


尽管DPPC和DMPS之间离子脂质相互作用的一些细节存在这些差异,但很明显,Ca2+在低表面压力下诱导两种脂质中有序结构域的形成,在中等表面压力下诱导无序结构域的形成(对于DPPC),在最高表面压力下诱导高度有序结构域的形成。对于这两种脂质,观察到明显的证据表明脂质和Ca2+之间形成复合物,但Na+不存在。钠对脂质单分子膜的影响要小得多,主要是在高表面压力下引起紊乱(最明显的是DMP)。在研究头部附近水分子的方向时,观察到两种脂质之间的其他相似性。O-D拉伸振动中D2O亚相上DPPC和DMPS的VSFG光谱(未显示数据)表明,水合水分子在阴离子和两性离子头基附近以相同的方式取向。这表明PC表现为阴离子脂质,因为DPPC的头基与其胆碱基团朝向界面。32因此,钙与PC和PS磷脂的相互作用类似并不奇怪,很可能与磷酸盐部分协调。


结论


综上所述,我们结合三种互补技术来研究阳离子对PC和PS单分子膜的影响。我们的结果表明,钠离子对DPPC单分子膜的影响很小,主要是扩张脂质单分子膜。另一方面,钙有明显的效果,这在很大程度上取决于表面压力。在低表面压力下,钙离子诱导形成小而有序的脂质结构域,随着表面压力的增加,这些脂质结构域合并成更大的脂质结构域。在高表面压力下,Ca2+对两性离子脂质和阴离子脂质单层都产生“缩合效应”,表明离子优先与脂质头基中的磷酸部分相互作用。在VSFG和表面张力测量中,Ca2+与脂质结合的分子特征从水和Ca溶液上的单分子膜之间的信号变化中可以明显看出,对应于4Å2/脂的面积变化,精确地说是Ca2+离子的表面积。


确认


这项工作是“材料粘贴voor Fundamenteel Onderzoek(FOM)”研究项目的一部分,该项目由“荷兰voor Wetenschapelijk Onderzoek(NWO)”组织资助。我们感谢本特·卡塞莫(BengtKasemo)建议进行这项实验,并感谢克里斯蒂安·蒂舍尔(Christischer)和拉杰什·皮莱(RajeshPillai)对荧光显微镜的帮助。


可用支持信息:实验部分,DMPS单分子膜的VSFG光谱,以及使用和频生成的分子取向分析。此材料可通过以下网址免费获取:http://pubs.acs.org.