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槐糖脂的属性:脂肪酸底物和混合比例的影响——材料和方法

来源:上海谓载 浏览 15 次 发布时间:2021-11-17

材料和方法


材料


所有培养基成分均从Sigma-Aldrich化学公司购买,但由Fluka Biochemika(瑞士Buchs)经销的酵母提取物除外,且所有溶剂均为HPLC级,并从Burdick和Jackson(密歇根州Muskegon)处购买。


槐脂合成


在假丝酵母生长培养基(CGM)中制备假丝酵母ATCC 22214接种物,该培养基由以下物质组成(g/l):葡萄糖,100;酵母抽提物,10;和尿素,1,根据先前公布的方法(Ashby等人,2005年)。在2.5升台式发酵罐(Bioflo III间歇式/连续式生物反应器,新泽西州新不伦瑞克)中,在2升培养基中进行槐脂合成。基本SL生产培养基(CGM培养基)由上述相同成分和相同比例组成。用浓盐酸将pH值调至6.0,并通过高压灭菌对CGM培养基进行灭菌。灭菌后,将温度平衡至26℃,并将棕榈酸、硬脂酸、油酸或亚油酸作为脂质共基质以2%(w/v)的比例添加到培养基中,使每个培养基在接种前的最终pH值为5.8±0.2。添加棕榈酸和硬脂酸作为不溶性固体,而添加油酸和亚油酸作为不混溶液体。将50 ml冷冻接种培养物解冻并用于接种每次发酵。生长/生产条件如下:温度=26-C,搅拌(叶轮转速)=700 rpm,空气流量=2 l空气/分钟,无pH控制。2天后,向发酵液中添加额外的5%(w/v)干葡萄糖和2%(w/v)脂肪酸,当添加额外的0.5%(w/v)脂肪酸时,允许发酵持续5天。然后继续发酵2天(发酵的总持续时间为7天)。


槐脂的分离纯化


为了分离SLs,将整个培养物(细胞和肉汤)分成等份,并冻干(*2天)。将干燥的残留物放入1 l锥形烧瓶中,通过在250 rpm、30-C下摇晃2天,用过量的乙酸乙酯提取每部分。在整个提取过程中,定期移除50 ml乙酸乙酯,并通过TLC测试内酯相对于开链形式的优先溶解度的可能性(过程见下文)。提取物通过Whatman 2号滤纸过滤,剩余固体用乙酸乙酯洗涤两次(每次500 ml),以最大限度地提高回收率。通过蒸发浓缩含有SLs的合并乙酸乙酯馏分,并将其添加到1 l己烷中以沉淀纯SLs。通过过滤从己烷中回收纯SLs,并在干燥器中真空干燥以获得细白色粉末,然后精确称量以获得产品产率。


槐脂分析


使用硅胶板(250 lm层厚,17 lm粒径,60 A˚孔径(Sigma-Aldrich)和氯仿/甲醇/水(80:20:1,体积比为溶剂)通过薄层色谱法阐明SL在乙酸乙酯中的优先溶解度和分馏。显影剂为乙醇中的5%(w/v)磷钼酸,然后炭化。


如前所述测定SL含量(Nun〜ez等人,2001)。简言之,SL混合物通过HPLC使用Waters 2690分离模块(Waters公司)使用15 cm 9 2.1 mm对称C18 3.5 lm柱进行分离。使用线性梯度洗脱法从水/乙腈(0.5%甲酸)/乙腈(50:10:40,体积比)中进行洗脱并在25分钟内将其与乙腈(0.5%甲酸)/乙腈(10:90,体积比)保持5分钟,总运行时间为35分钟。流速为0.25 ml/min。将流出物连接到带有APCI探针的微型质量ZMD质谱仪(水)设置为正模式,每次扫描2秒,从m/z 200扫描到m/z 1000。电晕针电压调整为3.8 kV,样品锥20 V,提取锥2 V,用于检测碎片和分子离子([m]+)。


表面活性测定


在滴体积Kru–ss DVT30张力计(Kru–ss USA,北卡罗来纳州夏洛特)上测量油水界面张力(IFT)。水相含有200mg表面活性剂/l,0.01M Na2SO4,0.77mm CaCl2,0.26mm MgCl2,pH值8.0。油菜(菜籽)油用作油相。在10微升油/分钟时记录三次测量的平均值。使用Kibron Delta-8张力计(Kibron Inc.,芬兰赫尔辛基)测定临界胶束浓度(CMC)和最小表面张力(min.ST)。样品溶液含有0.01 mNa2SO4、0.77 mM CaCl2、0.26 mM MgCl2和各种浓度的表面活性剂,pH值为8.0。所有物理性质测量均在室温下进行。


槐糖脂的属性:脂肪酸底物和混合比例的影响——摘要、介绍

槐糖脂的属性:脂肪酸底物和混合比例的影响——材料和方法

槐糖脂的属性:脂肪酸底物和混合比例的影响——结果与讨论

槐糖脂的属性:脂肪酸底物和混合比例的影响——结论、致谢!